河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011

miR-222通過下調(diào)DDIT4抑制腎癌細(xì)胞自噬

倪曉辰，趙志紅，馬永良，任宗濤，劉彬，張愛莉

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011

背景與目的：微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。miR-222在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而其在腎癌(renal cell carcinoma，RCC)中的表達(dá)及其作用機制尚不清楚。本研究擬通過檢測RCC組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-222的表達(dá)情況，探討miR-222在RCC中的作用。并在體外條件下，通過檢測miR-222的下游作用靶點，探討miR-222的抗RCC作用機制。方法：采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測RCC組織和癌旁組織中miR-222的表達(dá)；采用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力；采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測DDIT4蛋白及LC3-Ⅱ的表達(dá)；采用熒光素酶實驗驗證miR-222的作用靶點；轉(zhuǎn)染EGFP-LC3后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬狀態(tài)。結(jié)果：qRTPCR檢測結(jié)果顯示，miR-222在RCC組織中表達(dá)明顯上調(diào)。在人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株中敲低miR-222表達(dá)后顯著抑制細(xì)胞的增殖活力，而過表達(dá)miR-222可增強786-O細(xì)胞的增殖活力(P＜0.01)。在786-O細(xì)胞中敲低miR-222后，其靶基因DDIT4蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)miR-222后，DDIT4表達(dá)明顯下調(diào)。熒光素酶實驗結(jié)果表明，DDIT4為miR-222的直接作用靶點。RCC組織的DDIT4表達(dá)下調(diào)。在786-O細(xì)胞中抑制miR-222表達(dá)后，LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著上調(diào)，自噬體數(shù)目顯著增加。結(jié)論：miR-222在RCC中高表達(dá)，并可能通過靶向抑制DDIT4的表達(dá)參與調(diào)控RCC細(xì)胞自噬。

miR-222；腎癌；DDIT4；自噬

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類胞內(nèi)小分子RNA，它們通過與mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合使靶基因沉默，從而抑制miRNA調(diào)控靶基因的表達(dá)。隨著近年來對miRNA研究的逐步深入，越來越多的研究證實，miRNA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。因此，miRNA的功能研究對于認(rèn)識疾病的發(fā)展過程及尋求疾病治療的新靶點具有重要的臨床意義。

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤患者中，RCC患者比例大約占到了2%，每年全世界新發(fā)RCC患者超過200 000例［1］，據(jù)估計2014年全美新發(fā)腎臟腫瘤患者將會達(dá)到63 920例，而死于腎臟腫瘤的患者數(shù)量更將會達(dá)到13 860例［2］。因此，研究RCC細(xì)胞中的關(guān)鍵分子的作用機制，對于深入了解該疾病的發(fā)展過程以及靶向治療有重要意義。以往的研究表明，miR-222在乳腺癌［3］、甲狀腺癌［4］、腦膠質(zhì)瘤［5］和胃癌［6］等多種腫瘤中都具有顯著的調(diào)控作用，說明miR-222在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于miR-222在RCC中的功能尚不清楚。本研究通過檢測miR-222在RCC組織中的表達(dá)及干擾人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞株中miR-222的表達(dá)為模型，探討miR-222在RCC細(xì)胞中的作用機制，為RCC的分子靶向治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本采集

RCC組織取自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2013年3月1日—2013年5月8日住院并進(jìn)行RCC根治性切除，術(shù)后病理證實為RCC的患者共23例，其中男性16例，女性7例，平均年齡為(67±7.5)歲。各組織標(biāo)本分為RCC組織和相應(yīng)癌旁組織，手術(shù)切下后迅速凍存于液氮保存?zhèn)溆?。本研究遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及受試者的知情同意。

1.2 主要試劑

人RCC細(xì)胞786-O及人胚腎小管上皮細(xì)胞HEK 293購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；EGFPLC3質(zhì)粒由日本大阪大學(xué)Tamotsu Yoshimori教授惠贈；RPMI-1640及DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000、High Capacity cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及TaqMan miRNA檢測試劑盒購自美國Life Technologies公司；miRNeasy迷你試劑盒購自德國Qiagen公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司；miR-222類似物、抑制物及其陰性對照購自上海吉瑪公司；CCK-8購自日本東仁化學(xué)研究所；本研究所使用抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 組織總RNA提取及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

將各組織取出并研磨，使用miRNeasy迷你試劑盒按照試劑盒說明提取組織總RNA之后，采用High Capacity cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用TaqMan miRNA檢測試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測，U6作為各組樣品的內(nèi)參，以miR-222與U6的比值作為該樣品中miR-222的相對表達(dá)強度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

786-O、HEK 293細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基或DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。miR-222類似物、抑制物及其陰性對照和EGFP-LC3質(zhì)粒均使用LipofectamineTM2000，并按使用說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后分別進(jìn)行蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測或使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖實驗

將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁分別轉(zhuǎn)染miR-222類似物、抑制物及其陰性對照，溫育48 h后，每孔分別加入10 μL CCK-8，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)溫育，實時觀察，適時終止，450 nm酶標(biāo)儀比色。

1.6 Western blot檢測

將細(xì)胞或組織總蛋白裂解后定量，將等量蛋白上樣于SDS-PAGE中電泳。之后將蛋白恒流電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，之后用相應(yīng)一抗于4 ℃下溫育過夜。第2天，用TBST溶液洗膜，之后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫封閉1 h。洗膜后，用化學(xué)發(fā)光儀檢測目的條帶的表達(dá)。

1.7 雙熒光素酶實驗

分別將含有野生型及突變型DDIT4 3’UTR的報告基因質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、miR-222類似物及其對照轉(zhuǎn)染入HEK 293細(xì)胞中，48 h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒使用說明進(jìn)行操作，并在多功能酶標(biāo)儀上分別檢測螢火蟲及海腎熒光素酶的活性。以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度比值反映各組的相對熒光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RCC組織的miR-222表達(dá)上調(diào)

提取RCC組織及相應(yīng)癌旁組織的總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，RCC組織的miR-222表達(dá)水平較對照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖1)。

2.2 miR-222調(diào)控RCC細(xì)胞增殖

CCK-8細(xì)胞增殖試驗結(jié)果顯示，在對786-O細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222類似物48 h后，細(xì)胞的增殖活力明顯增強，而轉(zhuǎn)染了miR-222抑制物antagomiR-222 48 h之后，細(xì)胞的增殖活力較對照組受到了明顯的抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，P＜0.01)。

圖1 miR-222在RCC及癌旁組織的表達(dá)情況Fig. 1 Differential expression of miR-222 in RCC and adjacent tissues

圖2 miR-222調(diào)控786-O細(xì)胞增殖Fig. 2 The effects of miR-222 on proliferation in 786-O cells

2.3 miR-222調(diào)控DDIT4蛋白在RCC細(xì)胞中的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討miR-222的作用靶點，我們使用了TargetScan預(yù)測系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)DDIT4可能是miR-222的潛在靶點。為了驗證這一假設(shè)，我們首先將miR-222類似物、抑制物及相應(yīng)對照分別轉(zhuǎn)染到人腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞內(nèi)。結(jié)果表明在抑制了miR-222之后，786-O細(xì)胞DDIT4蛋白的表達(dá)量較對照組顯著升高，而過表達(dá)miR-222之后，DDIT4的表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.01，圖3A、B)。為進(jìn)一步探討DDIT4是否為miR-222的直接作用靶點，我們分別將含有野生型及突變型DDIT4 3’UTR的熒光報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK 293細(xì)胞中，結(jié)果顯示，miR-222可顯著抑制轉(zhuǎn)染有野生型DDIT4 3’UTR質(zhì)粒細(xì)胞的熒光強度，而對于轉(zhuǎn)染有突變型DDIT4 3’UTR質(zhì)粒細(xì)胞的熒光強度無明顯影響(圖3C)。Western blot檢測結(jié)果表明，RCC組織中DDIT4蛋白的表達(dá)量較相應(yīng)癌旁組織明顯下降(圖3D)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3E)。上述結(jié)果說明，DDIT4可能是miR-222的作用靶點，其表達(dá)量受miR-222的負(fù)調(diào)控。

2.4 miR-222參與調(diào)控RCC細(xì)胞自噬

已有文獻(xiàn)報道DDIT4可以激活自噬，并可影響腫瘤細(xì)胞生長［7］。由于miR-222可以抑制DDIT4的表達(dá)，所以我們推測miR-222可能具有抑制細(xì)胞自噬的作用。為了驗證這一假設(shè)，我們將編碼EGFP-LC3融合蛋白的質(zhì)粒pEGFP-LC3和miR-222抑制物共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬狀況，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-222抑制物的細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光點數(shù)較對照組顯著增多(P＜0.01，圖4A、B)。 Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了miR-222抑制物的786-O細(xì)胞，LC3-Ⅱ型蛋白的表達(dá)量較對照組顯著升高(圖4C、D)。結(jié)果表明，miR-222可抑制腎癌細(xì)胞自噬。

圖3 miR-222調(diào)控RCC細(xì)胞DDIT4蛋白的表達(dá)Fig. 3 miR-222 regulated DDIT4 expression in RCC cell

圖4 miR-222抑制786-O細(xì)胞自噬Fig. 4 miR-222 inhibited autophagy in 786-O cells

3 討 論

miRNA是一類在細(xì)胞內(nèi)起到調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，能與靶基因的3’UTR結(jié)合，通過抑制翻譯過程或促進(jìn)靶基因mRNA降解來調(diào)控靶基因蛋白的表達(dá)［8］。miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，深入研究miRNA在腫瘤中的調(diào)控機制，對腫瘤的診斷和治療都具有非常重要的意義。miR-222已知在多種腫瘤中存在著表達(dá)異常［3-6］。Zhang等［9］報道，miR-222的高表達(dá)與膀胱癌的不良預(yù)后呈正相關(guān)。Quintavalle等［10］的研究結(jié)果表明，miR-222能夠調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞基因損傷修復(fù)障礙，從而引起細(xì)胞死亡。Yang等［11］的研究結(jié)果表明，miR-222能夠通過靶向抑制p27基因的表達(dá)阻斷肝癌細(xì)胞周期，并抑制肝癌細(xì)胞的增殖。以往的研究表明miR-222在腫瘤中的功能復(fù)雜而重要，在腫瘤的診斷、治療和預(yù)后方面都具有潛在的應(yīng)用價值。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-222在RCC組織中表達(dá)量較癌旁組織顯著上升，miR-222能夠負(fù)向調(diào)控下游靶基因DDIT4蛋白的表達(dá)。DDIT4能夠激活TSC1/2復(fù)合物，從而抑制mTOR信號通路，繼而激活細(xì)胞自噬［12］。已有研究表明與miR-222同簇的miR-221可以通過靶向抑制DDIT4促進(jìn)肝癌的發(fā)生和肝癌細(xì)胞的生長［13］，而關(guān)于miR-222調(diào)控細(xì)胞自噬以及與DDIT4的關(guān)系目前未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)RCC中高表達(dá)的miR-222可以通過直接與DDIT4 3’UTR結(jié)合并負(fù)向調(diào)控DDIT4抑制RCC細(xì)胞自噬。

自噬是細(xì)胞最基本的生理過程之一，具有維持細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。在自噬過程中，自噬泡內(nèi)待降解的物質(zhì)被溶酶體內(nèi)的酸性水解酶水解成為核酸、氨基酸、脂肪酸和糖原等小分子物質(zhì)，這些小分子物質(zhì)被重新釋放到細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的物質(zhì)再循環(huán)或細(xì)胞代謝功能［14］。目前已知多種疾病都與自噬功能障礙密切相關(guān)［15］。自噬在腫瘤中的功能非常復(fù)雜，目前還不是十分清楚，有假說提出，正常生理狀態(tài)下的自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)原發(fā)的引起DNA損傷的物質(zhì)，如活性氧、受損傷的線粒體和錯誤折疊的蛋白質(zhì)等，從而維持基因組DNA的完整性和穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生［16］。而我們的研究表明，在腎癌組織中，miR-222表達(dá)量顯著上調(diào)，并可通過抑制DDIT4的表達(dá)抑制細(xì)胞自噬。因此，我們推測miR-222在RCC組織中的高表達(dá)在一定程度上可能促進(jìn)了RCC的發(fā)生、發(fā)展。利用自噬治療腫瘤已經(jīng)成為近年來腫瘤治療研究領(lǐng)域的新熱點，如雷帕霉素、氯喹及其衍生物羥基氯喹等，目前部分研究已經(jīng)處于進(jìn)行臨床試驗，并有望應(yīng)用于臨床［17］。

本研究首次在人RCC組織中進(jìn)行了miR-222的檢測，發(fā)現(xiàn)miR-222在RCC組織中表達(dá)量明顯上調(diào)，RCC細(xì)胞的高miR-222水平可以抑制其下游作用靶點DDIT4蛋白的表達(dá)，從而抑制RCC細(xì)胞自噬。因此，本研究結(jié)果表明miR-222的高表達(dá)在RCC發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用，可能是RCC治療的潛在靶點。通過藥物調(diào)控miRNA等表觀遺傳因素可能是治療RCC的有效途徑。

［1］ BASTIEN L, CULINE S, PAULE B, et al. Targeted therapies in metastatic renal cancer in 2009［J］. BJU Int, 2009, 103(10): 1334-1342.

［2］ SIEGEL R, MA J, ZOU Z, et al. Cancer statistics, 2014［J］. CA Cancer J Clin, 2014, 64(1): 9-29.

［3］ CHEN W X, HU Q, QIU M T, et al. miR-221/222: promising biomarkers for breast cancer［J］. Tumour Biol, 2013, 34(3): 1361-1370.

［4］ JIHUZONO T, KAWAMOTO M, YOSHITAKE H, et al. The miR-221/222 cluster, miR-10b and miR-92a are highly upregulated in metastatic minimally invasive follicular thyroid carcinoma［J］. Int J Oncol, 2013, 42(6): 1858-1868.

［5］ HAO J, ZHANG C, ZHANG A, et al. miR-221/222 is the regulator of Cx43 expression in human glioblastoma cells［J］. Oncol Rep, 2012, 27(5): 1504-1510.

［6］ CHUN-ZHI Z, LEI H, AN-LING Z, et al. MicroRNA-221 and microRNA-222 regulate gastric carcinoma cell proliferation and radioresistance by targeting PTEN［J］. BMC Cancer, 2010, 10: 367.

［7］ BEN SAHRA I, REGAZZETTI C, ROBERT G, et al. Metformin, independent of AMPK, induces mTOR inhibition and cell-cycle arrest through REDD1［J］. Cancer Res, 2011, 71(13): 4366-4372.

［8］ BARTEL D P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions［J］. Cell, 2009, 136(2): 215-233.

［9］ ZHANG D Q, ZHOU C K, JIANG X W, et al. Increased expression of miR-222 is associated with poor prognosis in bladder cancer［J］. World J Surg Oncol, 2014, 12(9): 241.

［10］ QUINTAVALLE C, MANGANI D, ROSCIGNO G, et al. MiR-221/222 target the DNA methyltransferase MGMT in glioma cells［J］. PLoS One, 2013, 8(9): e74466

［11］ YANG Y F, WANG F, XIAO J J, et al. MiR-222 overexpression promotes proliferation of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells by downregulating p27［J］. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(48): 893-902.

［12］ DEYOUNG M P, HORAK P, SOFER A, et al. Hypoxia regulates TSC1/2-mTOR signaling and tumor suppression through REDD1-mediated 14-3-3 shuttling［J］. Genes Dev, 2008, 22(2): 239-251.

［13］ PINEAU P, VOLINIA S, MCJUNKIN K, et al. miR-221 overexpression contributes to liver tumorigenesis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(1): 264-269.

［14］ MIZUSHIMA N, KOMATSU M. Autophagy: renovation of cells and tissues［J］. Cell, 2011, 147(4): 728-741.

［15］ CHOI A M, RYTER S W, LEVINE B. Autophagy in human health and disease［J］. N Engl J Med, 2013, 368(19): 1845-1846.

［16］ WHITE E. Deconvoluting the context-dependent role for autophagy in cancer［J］. Nat Rev Cancer, 2012, 12(6): 401-410.

［17］ KIMURA T, TAKABATAKE Y, TAKAHASHI A, et al. Chloroquine in cancer therapy: a double-edged sword of autophagy［J］. Cancer Res, 2013, 73(1): 3-7.

miR-222 can inhibit the autophagy of renal cell carcinoma cells through down-regulating the expression of DDIT4

NI Xiaochen, ZHAO Zhihong, MA Yongliang, REN Zongtao, LIU Bin, ZHANG Aili (Department of Urology, the Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

ZHANG Aili E-mail: z13930409899@163.com

Background and purpose:MicroRNA (miRNA, miR) plays an important regulatory role in cancer. miR-222 is reported to be up-regulated in various tumors, but its role in renal cell carcinoma (RCC) remains unclear. In this study, we detected the expression of miR-222 in both RCC and adjacent tissue samples. The aim of this study was to investigate the role of miR-222 in RCC.Methods:The expression levels of miR-222 in RCC tissue samples were quantified by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). DDIT4 and LC3-Ⅱ protein expressions were determined by Western blot. Dual luciferase assay was performed to verify the target of miR-222. EGFP-LC3 microscopy assay was performed to assess autophagy.Results:Results from qRT-PCR showed that the expression of miR-222 was up-regulated in RCC tissues. Knockdown of miR-222 with specifc antagomiR decreased the cell viability of 786-O cells, whereas overexpression of miR-222 increased the cell viability (P＜0.01). The levels of DDIT4 were upregulated in 786-O cells transfected with miR-222 antagomiR, whereas overexpression of miR-222 induced the downregulation of DDIT4 expression. Data from dual luciferase assay indicated that miR-222 directly targeted the expression of DDIT4. Consistently, the expression of DDIT4 in RCC tissues was down-regulated compared with adjacent tissues. Knockdown of miR-222 in 786-O cells induced a signifcant increase of autophagosome formation and LC3 lipidation.These results supported that miR-222 could inhibit autophagy in RCC cells, which may affect the clinical characteristcs of RCC.Conclusion:miR-222 is up-regulated in RCC and can inhibit the autophagy of RCC cells through downregulating the expression of DDIT4.

miR-222; Renal cell carcinoma; DDIT4; Autophagy

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.03.001

R737.11

A

1007-3639(2015)03-0161-06

2014-08-30

2014-11-14）

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(20110142)。

張愛莉 E-mail:z13930409899@163.com