焦彩鳳，楊潤(rùn)強(qiáng)，顧振新*

植物性食品原料中異黃酮形成機(jī)理及富集的影響因素

焦彩鳳，楊潤(rùn)強(qiáng)，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

異黃酮屬酚類物質(zhì)，是苯丙烷類的次生代謝產(chǎn)物，大多存在于豆科植物中，對(duì)人體具有廣泛生理調(diào)節(jié)功能。本文綜述植物性食品原料中異黃酮形成的機(jī)理，以及基于環(huán)境誘導(dǎo)和基因改造層面調(diào)控異黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因表達(dá)，最終誘導(dǎo)異黃酮積累的技術(shù)。

異黃酮；形成機(jī)理；富集；影響因素

異黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物，對(duì)人體具有多種生理和藥理活性。研究表明異黃酮可與雌激素受體結(jié)合，在動(dòng)物和人體內(nèi)通過(guò)與在下丘腦、腦下垂體，肺、胸腺等組織中表達(dá)的雌激素受體（estrogen receptor，ERβ）結(jié)合，產(chǎn)生類雌激素作用[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，富含異黃酮的飲食能夠預(yù)防癌癥，尤其是性激素依賴性的乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[2]。異黃酮還有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、防治過(guò)敏癥與結(jié)腸炎等免疫紊亂疾病的功能[3]?？诜慄S酮制劑能改善絕經(jīng)后女性血管內(nèi)皮功能[4]。異黃酮能夠防治骨質(zhì)疏松癥，可減少骨質(zhì)丟失，促進(jìn)骨生成[5]。然而大豆、銀杏、歐芹等植物性食品原料中異黃酮提取率較低。采用生物技術(shù)處理后，可促進(jìn)異黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終誘導(dǎo)異黃酮積累。本文綜述植物食品原料中異黃酮富集機(jī)理及技術(shù)研究現(xiàn)狀，以期為富含異黃酮的食品原料開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 異黃酮形成機(jī)理及其富集的影響因素

1.1異黃酮形成機(jī)理

高等植物中異黃酮的合成從底物苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）開(kāi)始，經(jīng)由苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸:輔酶A連接酶（4-coumarate CoA-ligase，4CL）催化的一系列酶促反應(yīng)，生成前體p-香豆酰-CoA。p-香豆酰-CoA在查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮還原酶（chalcone reductase，CHR）的催化下生成柚皮素查耳酮或異甘草素。柚皮素查耳酮或異甘草素在查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下生成柚皮素或甘草素。柚皮素或甘草素在異黃酮合酶（isoflavone synthase，IFS）的催化下生成大豆異黃酮游離苷元如染料木黃酮、黃豆苷元和黃豆黃素，隨后在不同的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化下，生成相應(yīng)的結(jié)合型異黃酮[6]，具體過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 大豆異黃酮的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of soybean isoflavones

異黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶包括PAL、CHS、CHI和CHR。PAL作為苯丙烷類合成途徑的起始酶，可將初生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為大量的次生代謝產(chǎn)物，因而其催化活性直接影響整個(gè)途徑效率[7]。CHS是類黃酮合成途徑中第一個(gè)特異性關(guān)鍵酶。X射線衍射表明：CHS晶體結(jié)構(gòu)為兩個(gè)42 kD多肽的同源二聚體，每個(gè)單體有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，活性位點(diǎn)位于結(jié)構(gòu)域的裂縫[8]。CHS基因表達(dá)受光照、生物鐘、溫度、6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）和赤霉素A3（gibberellin A3，GA3）及P蛋白等調(diào)控[9]。CHI基因家族包含8個(gè)成員，分為CHI1、CHI2、CHI3和CHI4這4個(gè)亞家族[3]?；诖呋芰Γ珻HI基因可進(jìn)一步分為Ⅰ型和Ⅱ型CHI，I型CHI與類黃酮合成有關(guān)，Ⅱ型CHI則與異黃酮合成有關(guān)[7]。IFS是將黃烷酮代謝途徑引入異黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶，其作用的底物柚皮素是黃烷酮代謝途徑中許多酶的競(jìng)爭(zhēng)性底物，如在類黃酮3-羥化酶（flavonoids 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）的催化下形成黃烷酮醇，在黃酮合成酶（flavone synthase，F(xiàn)NS）催化下形成黃酮。因而IFS與黃烷酮代謝途徑中許多酶相互作用必然會(huì)影響異黃酮的合成[10]。

1.2影響異黃酮富集的因素

1.2.1生長(zhǎng)環(huán)境

植物中異黃酮的積累受環(huán)境因素調(diào)控。生長(zhǎng)環(huán)境中光照[11]、水分[12]、茉莉酸甲酯[13]等外界信號(hào)被植物細(xì)胞膜上的受體所識(shí)別并結(jié)合，引起膜通透性、細(xì)胞氧化還原態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化等一系列反應(yīng)，從而引起細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)量發(fā)生變化，異黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶結(jié)構(gòu)及其活性發(fā)生變化，最終調(diào)控異黃酮合成。此過(guò)程需要通過(guò)植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+、環(huán)鳥(niǎo)甘酸（guanosine 3’,5’-cyclic phosphate，cGMP）、激酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）等第二信使系統(tǒng)的關(guān)鍵組分將誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。

1.2.2基因改造

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，次生代謝工程能有效調(diào)控異黃酮的合成。目前已有的方法主要基于以下機(jī)理：1）過(guò)量表達(dá)限速酶，導(dǎo)致終產(chǎn)物含量的增加，這是植物代謝工程最常用的策略之一；2）通過(guò)引入轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)節(jié)多個(gè)基因的共同表達(dá)，協(xié)調(diào)控制整個(gè)代謝途徑；3）提高植物次生代謝途徑中某一分支代謝途徑中酶活性，使其在與另一分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，以提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，例如抑制與IFS競(jìng)爭(zhēng)同一底物（柚皮素）的F3H和FNS可促進(jìn)異黃酮的積累[14]。

2 異黃酮富集技術(shù)

在對(duì)異黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶及富集機(jī)理有較為清晰認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，科學(xué)工作者已將一些富集異黃酮的技術(shù)應(yīng)用于研究中。

2.1光誘導(dǎo)

光是植物生長(zhǎng)發(fā)育中一個(gè)重要的環(huán)境信號(hào)。目前的研究多集中于光對(duì)植物類黃酮合成中的一個(gè)重要的限速酶——苯基苯乙烯酮合酶基因CHS的誘導(dǎo)作用，該反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一些可能組分已被揭示。顯微注射和藥理學(xué)方法研究表明，西紅柿種子和大豆細(xì)胞培養(yǎng)物中光敏色素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)CHS表達(dá)[15]。活化的光敏色素A（phytochromeA，phyA）將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為三聚體G蛋白和第二信使（包括cGMP和酪氨酸激酶）。與光敏信號(hào)通路不同，cGMP和酪氨酸激酶不影響紫外光B波段（ultraviolet-B，UV-B）調(diào)節(jié)CHS的表達(dá)。鈣、鈣調(diào)蛋白和絲氨酸激酶等拮抗物顯著影響UV-B調(diào)節(jié)CHS的轉(zhuǎn)錄，但不抑制光敏色素對(duì)CHS基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[15]。

2.1.1光質(zhì)

紅光照射雖能顯著促進(jìn)發(fā)芽大豆的生長(zhǎng)，但抑制發(fā)芽大豆PAL活性和異黃酮合成。Kirakosyan等[16]的研究表明，紅光照射僅對(duì)實(shí)驗(yàn)選擇的5種基因型大豆中的一種產(chǎn)生作用，且遠(yuǎn)紅外光（750 nm峰值透射率）比紅外光（650 nm峰值透射率）更能促進(jìn)大豆的芽和根中葛根素、染料木素、黃豆苷元和黃豆苷等異黃酮的合成。紫外光、藍(lán)光和白光對(duì)誘導(dǎo)大豆合成mRNA、提高PAL活性和合成異黃酮具有促進(jìn)作用，其中紫外光的作用最強(qiáng)，但抑制大豆生長(zhǎng)。

擬南芥細(xì)胞培養(yǎng)物在UV-B照射數(shù)小時(shí)后，刺激CHS基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，而藍(lán)光照射不明顯，紅光和遠(yuǎn)紅光幾乎無(wú)反應(yīng)[17]。

不同光質(zhì)之間還存在互作效應(yīng)。紅外光、藍(lán)光和遠(yuǎn)紅外光處理歐芹細(xì)胞培養(yǎng)物均不產(chǎn)生黃酮，而紫外光處理10 min后即有效果。若在紫外光處理前后用紅外光、藍(lán)光、遠(yuǎn)紅外光處理，均能增強(qiáng)紫外光的效果[18]。

2.1.2光量

在一定的光照范圍內(nèi)，最適光照強(qiáng)度及時(shí)間可使異黃酮合成量最多。徐茂軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在0～60μmol/（m2·s）光照強(qiáng)度范圍內(nèi)， 發(fā)芽大豆PAL活性和異黃酮含量隨著紫外光照射強(qiáng)度的增加而顯著提高；當(dāng)紫外光照射強(qiáng)度超過(guò)60μmol/（m2·s）時(shí)，PAL活性和異黃酮含量上升幅度較小。隨著光質(zhì)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆芽苗菜的子葉中大豆異黃酮含量總體呈先上升后降低或持續(xù)降低的趨勢(shì)，而下胚軸中則相反[11]。

2.1.3光周期

異黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶受光周期控制，從而影響光誘導(dǎo)異黃酮合成的效果。Harmer等[20]在對(duì)擬南芥中8 000個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行微陣列測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，23個(gè)與苯丙素類成分生物合成相關(guān)基因的表達(dá)體現(xiàn)出晝夜節(jié)律性變化，大部分在黎明前表達(dá)量達(dá)到峰值，形成“酚類屏障”，以保護(hù)植物在白天免受光傷害。Kim等[21]以10 h光照、14 h黑暗處理后，再行連續(xù)光照的模式處理大豆葉片，發(fā)現(xiàn)IFS、CHI、F3H均表現(xiàn)出受晝夜規(guī)則調(diào)控的現(xiàn)象，這3種酶的mRNA含量隨之變化的現(xiàn)象很明顯：IFS的mRNA含量在光照下達(dá)到最大值，F(xiàn)3H的mRNA含量則在黑暗下達(dá)到最大值，可見(jiàn)兩者的表達(dá)量不是同時(shí)達(dá)到最大值的，這樣可以降低它們對(duì)底物柚皮素的競(jìng)爭(zhēng)作用。由于CHI的mRNA含量變化周期很短，因而CHI的mRNA最大值并不明顯，但是其最小值不是出現(xiàn)在F3H或IFS最大值時(shí)。

2.2 NO誘導(dǎo)

NO是植物中一種新型的信號(hào)分子，來(lái)源于臭氧（O3）脅迫或硝普酸鈉（sodium nitroprusside，SNP），可調(diào)控黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成過(guò)程。

2.2.1硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）途徑

在O3脅迫下，銀杏懸浮細(xì)胞中NO含量提高，NO淬滅劑對(duì)O3誘發(fā)銀杏細(xì)胞黃酮合成的抑制作用表明NO是O3誘發(fā)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累所必需的信號(hào)分子。O3處理可提高銀杏細(xì)胞NR活性，NR抑制劑鎢酸鹽（tungstate，TUN）和谷氨酰胺（glutamine，Gln）在抑制銀杏細(xì)胞中NR活性的同時(shí)還顯著抑制O3對(duì)銀杏細(xì)胞NO產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用，表明O3可能依賴NR途徑誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞產(chǎn)生NO[22]。

由SNP提供的NO激發(fā)懷槐細(xì)胞PAL活性，而PAL抑制劑氨氧乙酸有抑制NO激發(fā)異黃酮合成的作用，因而有理由認(rèn)為在NO作用下，異黃酮為從頭合成。DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果顯示，NO作用使得懷槐培養(yǎng)細(xì)胞DNA甲基化水平升高，且隨異黃酮的合成而呈動(dòng)態(tài)變化。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷可阻斷NO激發(fā)下異黃酮的合成。因此，NO激發(fā)懷槐培養(yǎng)細(xì)胞生成的異黃酮可能與DNA甲基化有關(guān)[23]。

2.2.2與cGMP共調(diào)控

白光照射下，所有受cGMP誘導(dǎo)的大豆異黃酮合成途徑中的基因也受SNP誘導(dǎo)。NO的激發(fā)效應(yīng)能被其抑制劑6-苯氨基-5,8-喹嗪阻斷。Northern blotting分析表明，NO作為共同調(diào)控子，在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)編碼黃酮合成酶的基因表達(dá)。SNP處理能瞬間使cGMP水平提高4倍。大豆子葉中黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)NO有響應(yīng)，而對(duì)cGMP無(wú)響應(yīng)，因而cGMP和NO在異黃酮合成過(guò)程中可能不是同時(shí)發(fā)揮作用的[24]。

2.3茉莉酮酸化合物處理

白羽扇豆種子在吸脹過(guò)程中，茉莉酮化合物能夠促進(jìn)其子葉中異黃酮含量增加[25]。茉莉酮酸（jasmonate，JA）及茉莉酮酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物脂質(zhì)衍生物，具有廣譜的生理效應(yīng)，可調(diào)控許多基因的表達(dá)[26]。茉莉酮化合物能夠誘導(dǎo)植物防御細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)植物次生代謝途徑中PAL、CHS等相關(guān)酶類合成[27]，改變植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以此響應(yīng)異黃酮的合成。

2.3.1改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)

在MeJA作用下，懷槐細(xì)胞異黃酮合成量顯著提高，且細(xì)胞內(nèi)染色很深的電子致密小體（electron-dense body，EDB）數(shù)量隨異黃酮含量的升高而增加，第9天達(dá)到峰值，且與異黃酮積累呈正相關(guān)，推測(cè)MeJA可能誘導(dǎo)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，以此響應(yīng)異黃酮的合成[28]。

2.3.2促進(jìn)關(guān)鍵酶基因表達(dá)

大豆黃化苗受傷后迅速積累的JA或外源添加的MeJA均能增加CHS和IFS基因表達(dá)量[13,21]。Creelman等[29]指出，在植物抗病方面，主要是依靠MeJA對(duì)次生代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用，尤其體現(xiàn)在對(duì)CHS和PAL基因的調(diào)節(jié)上，MeJA處理可使兩者mRNA少量增加。

2.4稀土元素（rare earth element，REEs）處理

鑒于REEs對(duì)植物生長(zhǎng)具有廣泛的促進(jìn)作用，很多學(xué)者將REEs用于促進(jìn)紫杉醇、黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成。由于REEs很難在短時(shí)期內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因而REEs可作為胞外信號(hào)起作用。

2.4.1改變細(xì)胞滲透性和結(jié)構(gòu)

利用電子顯微鏡觀察到鈰離子在細(xì)胞壁和質(zhì)膜上大量沉積，其中大部分被液泡包裹成晶體或無(wú)定形物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)植物次生代謝物的合成[30]。REES還有改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的作用，促進(jìn)細(xì)胞分化[31]。

2.4.2改變氧化還原態(tài)

適量的稀土元素鑭（La）、鈰（Ce）在顯著提高還原型谷胱甘肽（reduced glutathion，GSH）、抗壞血酸（ascorbic acid，ASC）含量和GSH/氧化型谷胱甘肽（glutathionedisulfid，GSSG）、ASC/脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）比率的同時(shí)，又明顯降低細(xì)胞中GSSG、DHA含量，從而改變細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)，進(jìn)而影響次生代謝途徑中PAL和IFS活性，最終調(diào)節(jié)異黃酮的合成[32]。

2.4.3改變酶結(jié)構(gòu)

UV-B輻射脅迫下，植物中PAL、C4H、4CL和CHS活性提高，類黃酮含量升高，但在恢復(fù)期急劇下降，這是由于UV-B輻射導(dǎo)致酪氨酸（tyrosine，Tyr）和色氨酸（tryptophan，Trp）熒光同時(shí)被淬滅，CHS肽鏈上酰氨基吸收峰及Tyr和Trp等芳香氨基酸的殘基對(duì)紫外吸收峰值下降，從而改變分子空間結(jié)構(gòu)，降低CHS活性。CHS蛋白表面存在大量負(fù)電荷集中區(qū)。La3+易與CHS蛋白相互作用，導(dǎo)致CHS蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。因而低劑量La3+與CHS肽鏈中的酰氨基團(tuán)上O或N原子及CHS肽鏈上Tyr和Trp等芳香氨基酸殘基發(fā)生作用后，使CHS微結(jié)構(gòu)變化，穩(wěn)定CHS結(jié)構(gòu)，從而對(duì)活性中心產(chǎn)生微擾作用，進(jìn)而影響CHS活性，促進(jìn)類黃酮合成，降低UV-B輻射誘導(dǎo)的自由基產(chǎn)生[30]。

2.5基因工程技術(shù)

通過(guò)基因工程的手段可改變次生代謝流向或擴(kuò)展乃至構(gòu)建新的代謝途徑，以大量積累代謝產(chǎn)物。

2.5.1加速限速反應(yīng)

Jung等[33]將含有編碼IFS基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入來(lái)自大豆液體培養(yǎng)胚細(xì)胞中，使轉(zhuǎn)基因種子中異類黃酮含量增加。Jung等[34]將IFS基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，使異黃酮合酶在其中表達(dá)，從而合成異黃酮，其中大豆苷元含量達(dá)到2 ng/mg。然而已有的研究表明，過(guò)量表達(dá)PAL、C4H、4CL、CHS、IFS和CHI等異黃酮合成途徑中單個(gè)關(guān)鍵酶，并不一定能使異黃酮含量顯著增加[35]。Sangeeta等[36]利用微陣列技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：CHS8基因是激活整個(gè)類苯基丙醇通路的關(guān)鍵基因，因而也是異黃酮累積的關(guān)鍵基因；CHS8基因的過(guò)量表達(dá)使得異黃酮支路代謝水平因主通路被激活而略有提高，異黃酮含量隨之呈略有增加。據(jù)此，易金鑫等[37]推測(cè)在主通路以外，異黃酮支路中可能還存在關(guān)鍵基因，兩者共同的過(guò)量表達(dá)使異黃酮含量顯著提高。研究證實(shí)CHS8是類苯基丙醇主路徑中的主基因，異黃酮支路中的IFS2基因在高異黃酮和低異黃酮品種中的表達(dá)差異亦達(dá)到顯著水平。利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在大豆上分別過(guò)量表達(dá)CHS8、IFS2和CHS8+IFS2，前兩者異黃酮含量較對(duì)照分別提高65.9%和34.4%，而后者提高82.3%，增幅達(dá)極顯著水平（P＜0.000 1）。由此證實(shí)大豆異黃酮積累由主通路中CHS8基因和支路中IFS2基因共同決定[37]。

2.5.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子策略

將玉米C1和R轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入大豆中，苯丙烷通路PAL、C4H、CHI、CHR、F3H和二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）基因被激活，染料木黃酮含量減少，黃豆苷含量增加，從而使總異黃酮含量增加。同時(shí)，抑制F3H表達(dá)基因的導(dǎo)入來(lái)抑制F3H與IFS競(jìng)爭(zhēng)底物柚皮素，從而阻斷花青素等黃酮類物質(zhì)合成。激活轉(zhuǎn)錄因子與抑制競(jìng)爭(zhēng)性途徑的共同作用可促進(jìn)大豆異黃酮積累[38]。

將擬南芥的轉(zhuǎn)錄因子GmMYB176轉(zhuǎn)染到大豆胚中分離的原生質(zhì)體中，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）監(jiān)控內(nèi)源CHS8的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，GmMYB176在大豆胚原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)，使CHS8轉(zhuǎn)錄水平在48 h內(nèi)增加169倍[39]。大豆毛狀根中GmMYB176基因沉默將導(dǎo)致異黃酮水平下降，表明GmMYB176對(duì)于異黃酮生物合成的必要性。但是過(guò)量表達(dá)GmMYB176并不能增加CHS8轉(zhuǎn)錄和異黃酮水平，這表明GmMYB176調(diào)控CHS8基因可能需要另外的輔助因子。亞細(xì)胞定位研究證實(shí)GmMYB176定位于核中，但其本身不具有核定位信號(hào)[39]。大豆基因組包含18個(gè)14-3-3蛋白，其中16個(gè)已被成功轉(zhuǎn)錄[40]。14-3-3蛋白中某一位點(diǎn)的缺失會(huì)改變GmMYB176的亞細(xì)胞定位[41]。雙分子熒光互補(bǔ)和酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)也表明，GmMYB176與14-3-3蛋白互作[42]，因而GmMYB176的核定位可能需要14-3-3蛋白與其pST的位點(diǎn)結(jié)合，從而促進(jìn)CHS8基因的表達(dá)，提高異黃酮含量[43]。

2.5.3改變代謝途徑流向

應(yīng)用反義技術(shù)和RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)可減少或阻塞非目標(biāo)代謝物的合成，從而改變植物分叉代謝途徑流向，為目標(biāo)產(chǎn)物合成提供更加充足的合成前體。

RNAi技術(shù)已被廣泛用于調(diào)控植物中苯丙烷類次生代謝產(chǎn)物的合成。Jiang Yina等[44]根據(jù)RNAi技術(shù)原理構(gòu)建的雙價(jià)RNA干擾植物表達(dá)載體使大豆中F3H和GmFNSII基因沉默，并分別構(gòu)建了兩基因的單價(jià)RNA干擾植物表達(dá)載體。通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834對(duì)大豆子葉轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證所構(gòu)建RNA干擾植物表達(dá)載體的效率。高效液相色譜分析結(jié)果顯示，與兩個(gè)單價(jià)RNAi載體相比，RNAi載體轉(zhuǎn)化生成的毛狀根中雙價(jià)RNAi載體更有利于總異黃酮的合成，根中轉(zhuǎn)化總異黃酮的量是對(duì)照組的2倍。

3 結(jié) 語(yǔ)

目前已初步探明植物性食品原料中異黃酮形成機(jī)理及影響其富集的因素。在諸多調(diào)控技術(shù)中，紫外光誘導(dǎo)作用及其機(jī)理的研究較為深入。但紫外光在促進(jìn)異黃酮積累的同時(shí)也會(huì)傷害植物。有必要將光誘導(dǎo)技術(shù)與添加外源NO、稀土元素、激素或外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及施肥等技術(shù)結(jié)合使用，以平衡異黃酮積累和植物生長(zhǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)異黃酮積累。例如，將紫外光誘導(dǎo)與SNP處理聯(lián)用，充分發(fā)揮內(nèi)源和外源NO在促進(jìn)異黃酮積累和植物生長(zhǎng)方面的調(diào)控作用。對(duì)于應(yīng)用代謝工程技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物方面，可考慮尋找更為有效的轉(zhuǎn)錄因子，并明確其調(diào)控異黃酮合成的關(guān)鍵酶的輔助因子，深入探討蛋白質(zhì)間互作在其中的作用，達(dá)到富集異黃酮的目的。植物性食品原料用生物技術(shù)富集異黃酮后，可作為制造功能性食品的原料，這必將具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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Formation Mechanism and Factors Influencing Accumulation of Isoflavones in Edible Plants

JIAO Caifeng, YANG Runqiang, GU Zhenxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Isoflavones, as phenolic components, are the secondary metabolites found mostly in legumes with many healthpromoting functions on humans. The latest research on the formation mechanism of isoflavones and accumulation techniques based on environmental induction and genetic modification in edible plants is summarized in this paper.

isoflavones; formation mechanism; accumulation; influencing factors

TS202.1

1002-6630（2015）11-0256-05

10.7506/spkx1002-6630-201511048

2014-08-11

江蘇省科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（BE2013430）

焦彩鳳（1990—），女，博士研究生，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)富集機(jī)理與技術(shù)。E-mail：291454291@qq.com

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榛钚晕镔|(zhì)富集機(jī)理與技術(shù)。E-mail：guzx@njau.edu.cn