周笑犁，孔祥峰*

大豆寡糖對體外發(fā)酵腸道微生物的影響

周笑犁1,2，孔祥峰2,3,*

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽550005；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙410125；3.中國科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗(yàn)站香豬研究中心，廣西 環(huán)江547100）

旨在通過體外發(fā)酵技術(shù)研究大豆寡糖（soybean oligosaccharides，SBOS）對香豬腸道微生物的影響。無菌采集環(huán)江香豬的空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物作為接種物，分別以0（對照 組）、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%的SBOS和2.0%葡萄糖為底物進(jìn)行體外發(fā)酵。利用末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（terminal restriction fragment length polymorphism，T-R FLP） 分析48 h后發(fā)酵液微生物區(qū)系，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測定發(fā)酵液中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌和鏈球菌的16S rDNA變化。結(jié)果表明：SBOS提高了發(fā)酵液微生物的多樣性；隨著SBOS添加量的增大，發(fā)酵液中有益菌先增加再減少、而有害菌呈先減少后增加的趨勢，其中以2.0%的SBOS添加量發(fā)酵效果最優(yōu)，促進(jìn)了回腸和盲腸發(fā)酵液中雙歧桿菌的增殖（P＜0.05）、降低了盲腸發(fā)酵液中大腸桿菌和鏈球菌的增殖（P＜0.05）。

大豆寡糖；體外發(fā)酵；腸道微生物

動物胃腸道中復(fù)雜而動態(tài)平衡的微生物區(qū)系對宿主的健康和營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收起著重要的作用。隨動物種類、年齡和日糧等的變化，微生物的種類和數(shù)量也有差異[1]。大豆寡糖（soybean oligosaccharides，SBOS）是大豆中或其他豆科作物種子中所含有的可溶性糖類的總稱，主要由水蘇糖、棉子糖和蔗糖組成，能替代蔗糖應(yīng)用在功能性食品或低能量食品中[2]。許多研究指出，SBOS具有調(diào)節(jié)動物胃腸道微生物區(qū)系、提高機(jī)體免疫功能、降低患病率以及改善生產(chǎn)性能等多種生物學(xué)功能[3-4]。筆者的前期研究表明，在日糧中添加0.5%的SBOS可促進(jìn)香豬腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，改善機(jī)體氨基酸平衡和蛋白質(zhì)代謝[5]?？梢姡琒BOS對提高機(jī)體的營養(yǎng)狀況具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。SBOS是否通過調(diào)控腸道微生態(tài)來發(fā)揮上述有益作用，目前尚未見相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)利用體外發(fā)酵模型研究不同劑量的SBOS對香豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并利用實(shí)時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）技術(shù)進(jìn)一步測定了部分細(xì)菌數(shù)量的變化，旨在為進(jìn)一步探討SBOS調(diào)控腸道微生物及在腸道中的益生作用提供必要的理論參考。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

大豆寡糖（SBOS，含量大于85%） 南通四海植物精華有限公司，其中含有水蘇糖（≥55%）和棉子糖（≥25%），水分含量低于5%。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；5 U/μLLATaq、12 U限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、2×SYBR Green PCR Master Mix日本TaKaRa公司。

7900HT RT-PCR儀、3100毛細(xì)管電泳自動序列分析儀 美國ABI公司。

1.2培養(yǎng)液制備

參考Barry等[6]的方法配制培養(yǎng)液。微量培養(yǎng)液組成（g/L）為：NaHCO39.240、Na2HPO4·12H2O 7.125、NaCl 0.470、KCl 0.450、Na2SO40.100、CaCl20.055、MgCl20.047、尿素0.400，加蒸餾水定容至1 000 mL，混勻。痕量緩沖液組成（g/L）為：FeSO4·7H2O 3.68、M n S O4·7 H2O 1.9、Z n S O4·7 H2O 0.4 4 0、CoCl2·6H2O 0.120、CuSO4·5H2O 0.098、Mo7(NH4)6O24·4H2O 0.017 4，加蒸餾水定容至1 000 mL，混勻。使用前在1 L微量培養(yǎng)液中加入10 mL痕量緩液，混勻備用。上述所有試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.3體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

選用正常飼喂的環(huán)江香豬，放血處死后，采集空腸、回腸和盲腸的內(nèi)容物，立即放入事先充有CO2的無菌保溫瓶內(nèi)，混勻。稀釋腸道內(nèi)容物前，37℃水浴條件下向培養(yǎng)液中連續(xù)沖入CO230 min，將pH值調(diào)整至6.9～7.0。將采集的腸道內(nèi)容物與培養(yǎng)液混勻（1∶100，m/V），分裝于100 mL注射器內(nèi)，并在注射器中加入一定量的SBOS或葡萄糖。樣品處理不得超過30 min，最后將注射器放到搖床上37℃水浴振蕩培養(yǎng)48 h[7-9]。

SBOS的添加劑量：設(shè)6個添加水平，即分別在培養(yǎng)液中添加0（對照組）、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%和8.0%的SBOS；同時在培養(yǎng)液中添加2.0%葡萄糖的陽性對照。每個處理4個平行，接種物為回腸內(nèi)容物。確定最適SBOS添加量后，接種物分別為空腸、回腸和盲腸的內(nèi)容物，每個處理3個平行。

1.4測定指標(biāo)與方法

1.4.1發(fā)酵液微生物DNA提取

發(fā)酵結(jié)束后，將各組發(fā)酵液12 000×g離心20 min取沉淀，并分裝至1.5 mL離心管中-70 ℃保存。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取發(fā)酵液中細(xì)菌基因組總DNA，采用微量分光光度計(jì)測定DNA濃度，并以O(shè)D260nm/OD280nm評價DNA純度。

1.4.2發(fā)酵液微生物末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析

PCR擴(kuò)增l6S rDNA全長，以獲得微生物總DNA作為模板。用6-羧基熒光標(biāo)記的細(xì)菌通用引物8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’擴(kuò)增。50μL的擴(kuò)增體系中包括2.5 ng DNA模板、5μL10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+plus）、8μL2.5 mmol/L dNTP mixture、20μm引物，0.5μL5 U/μLLATaq。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，5 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取1.0μg擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，分別加入12 U限制性內(nèi)切酶HaeⅢ及相應(yīng)緩沖液和超純水，使反應(yīng)體系為20μL，37 ℃過夜溫育。限制性內(nèi)切酶HaeⅢ對純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切的識別位點(diǎn)為：5’…GG|CC…3’…CC|GG…5’。ABI3100毛細(xì)管電泳自動序列分析儀分析熒光標(biāo)記的末端限制性片段（T-RF），此步驟交由上海桑尼生物科技有限公司處理[10-11]。

1.4.3發(fā)酵液微生物實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）分析

采用SYBR GreenⅠ染料法，在real time-PCR儀上擴(kuò)增不同細(xì)菌的16S rDNA序列，并運(yùn)用Applied Biosystem SDS 2.3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。10μL反應(yīng)體系包括：5μL2×SYBR Green PCR Master Mix，0.2μL染料ROX，0.2μL10μmol/L上、下游引物（表1），2μLDNA模板，ddH2O補(bǔ)充至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s；95℃5 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)?；诳偧?xì)菌16S rDNA基因相對定量分析樣品中的雙歧桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌和大腸桿菌，采用2-ΔΔCt法[12]統(tǒng)計(jì)目的基因的表達(dá)量，即以總細(xì)菌為內(nèi)參，待測細(xì)菌表達(dá)量以-Δ ΔCt表示。

ΔCt=（Ct目的基因-Ct總細(xì)菌）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct總細(xì)菌）對照組

表1 腸道部分微生物real time-PCR引物參數(shù)Table 1 Parameters of primers for several intestinal microbes

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1大豆寡糖對發(fā)酵液微生物區(qū)系的影響

表2 不同添加量大豆寡糖對發(fā)酵液中回腸微生物酶切末端限制性片段含量的影響（nn == 44）Table 2 Effect of SBOS concentration on ileum microbial terminal rreesstriction fragments (T-RFs) in fermentation broth (n == 44))

由表2可知，隨著SBOS添加量的增加，回腸發(fā)酵液微生物區(qū)系呈增加趨勢，T-RF數(shù)分別為25、25、27、28和25，提示過低或過高的SBOS添加量不會增加回腸發(fā)酵液微生物的區(qū)系。

表3 22..00%大豆寡糖對不同腸段發(fā)酵液中微生物酶切末端限制性片段含量的影響（nn == 33）Table 3 Effect of 2.0%SBOS on intestinal microbe T-RFs in fermentation broth (n = 33))

由表3可知，空腸、回腸和盲腸發(fā)酵液微生物的T-RF數(shù)，葡萄糖組分別為17、19和24，而2.0%SBOS組分別為20、24和28；與葡萄糖組相比，SBOS組在空腸、回腸和盲腸發(fā)酵液微生物的T-RF數(shù)均增加，說明SBOS提高了發(fā)酵液微生物的多樣性。

2.2大豆寡糖對發(fā)酵液中細(xì)菌16S rDNA表達(dá)的影響

由表4可知，SBOS組和葡萄糖組發(fā)酵液中雙歧桿菌16S rDNA表達(dá)量均高于對照組；其中雙歧桿菌和乳酸桿菌16S rDNA表達(dá)量隨著SBOS添加量的增加呈先增加后減少的趨勢，而大腸桿菌16S rDNA表達(dá)量卻呈先減少再增加的趨勢；當(dāng)SBOS的添加量為2.0%時，發(fā)酵液中雙歧桿菌16S rDNA表達(dá)量顯著高于其他各組（P＜0.05），而大腸桿菌（P＞0.05）和鏈球菌（P＜0.05）的16S rDNA表達(dá)量最低。當(dāng)SBOS添加量為5.0%SBOS時，發(fā)酵液中乳酸桿菌16S rDNA的表達(dá)量顯著高于其他各組（P＜0.05）。

表5 22..00%大豆寡糖對不同腸段發(fā)酵液中微生物16S rDNA相對表達(dá)量的影響（n==33）Table 5 Effect of 2.0%SBOS on the relative expression level of16S rDNA in microbes from different intestinal segments infermentation brotthh ((n = 33))

由表5可知，空腸、回腸和盲腸微生物發(fā)酵后，其2.0%SBOS組發(fā)酵液中細(xì)菌的16S rDNA表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。與葡萄糖組相比，SBOS組回腸和盲腸發(fā)酵液中雙歧桿菌16S rDNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），盲腸發(fā)酵液中大腸桿菌和鏈球菌16S rDNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

在正常生理情況下，豬胃腸道中的主要菌群為乳酸桿菌屬、鏈球菌、擬桿菌屬、梭菌屬、沙門氏菌、梭桿菌門和真細(xì)菌等[13-14]。腸道微生態(tài)系統(tǒng)是在一定的生理范圍內(nèi)變動，但腸道微生態(tài)平衡一旦被打破，會表現(xiàn)為腸道菌群比例失調(diào)和細(xì)菌易位，常導(dǎo)致有害菌的大量繁殖，引起腹瀉等腸道疾病，嚴(yán)重影響動物健康[13-15]。日糧中的營養(yǎng)成分是影響腸道微生物菌群的組成和機(jī)體代謝最主要的因素，腸道微生物和營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收之間的關(guān)系密切用[13]。一般認(rèn)為，發(fā)酵底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和微生物種類對發(fā)酵過程中各種代謝產(chǎn)物的組成和比例具有一定的影響[14]。不可消化的寡糖和多糖等碳水化合物作為微生物的主要發(fā)酵底物，可影響微生物發(fā)酵產(chǎn)物的種類和數(shù)量，目前的研究主要集中在果寡糖、甘露寡糖等，有關(guān)SBOS對單胃動物腸道微生物體外發(fā)酵研究的相關(guān)報道較少。

由于動物實(shí)驗(yàn)費(fèi)時、費(fèi)力且成本較高，用腸道內(nèi)容物為接種物進(jìn)行體外發(fā)酵是預(yù)測發(fā)酵底物營養(yǎng)價值的一種簡捷、經(jīng)濟(jì)的方法[16]。李萬坤等[17]用雞腸道微生物對多種植物活性多糖進(jìn)行體外發(fā)酵，結(jié)果表明多糖和寡糖均能顯著改變腸道微生物活性，且多種生物活性多糖顯著改變了腸道微生物菌群；張學(xué)峰等[4]報道了SBOS對綿羊瘤胃微生物區(qū)系影響顯著，可提高纖維分解菌的數(shù)量，有利于纖維物質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解，并且減少了瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)通過T-RFLP分析表明，2%SBOS能夠提高各腸段發(fā)酵液中微生物的多樣性，其中以大腸發(fā)酵液的微生物區(qū)系尤為豐富。這可能是由于大腸中棲居著大量微生物，SBOS被大腸微生物分泌的酶降解或微生物自身酵解后為腸道微生物提供能量，并促進(jìn)了細(xì)菌的大量增殖。這與之前筆者關(guān)于發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的報道一致，即與小腸發(fā)酵液相比，SBOS增加了大腸發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的濃度、減少了NH3-N濃度[18]，進(jìn)一步證實(shí)了SBOS主要在大腸被微生物降解，提高了微生物區(qū)系組成，并以2.0%為SBOS的最適添加劑量。

動物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的建立是一個動態(tài)變化過程。如果腸道優(yōu)勢菌屬為致病性的厭氧菌（如梭桿菌和梭狀芽孢桿菌）和兼性厭氧菌（如大腸桿菌），那么其產(chǎn)生的還原性酶會將尿素轉(zhuǎn)化成氨可能導(dǎo)致直腸癌[19-20]。Lan等[21]報道了SBOS添加到雞飼料中，可選擇性地促進(jìn)盲腸中乳酸菌的增殖，并抑制了病原菌的增殖；腸道微生物酵解不同底物會產(chǎn)生不同的代謝物，且組成比例也不相同。Gibson等[22]報道，雙歧桿菌的增加往往伴隨著梭菌屬的減少，雙歧桿菌對宿主的代謝具有非常有益的作用，可通過黏膜免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等方式影響宿主的健康。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時熒光定量PCR分析表明，SBOS具有選擇性調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌種類與數(shù)量的作用，提高了發(fā)酵液中雙歧桿菌的數(shù)量，并抑制了大腸桿菌和鏈球菌的生長。陳瓊等[23]也有類似的報道，即大豆低聚糖可為有益菌的生長提供營養(yǎng)成分，而有益菌數(shù)量的增加，降低了腸道環(huán)境的pH值，抑制了有害菌的生長。并且在本實(shí)驗(yàn)中以2.0%SBOS對雙歧桿菌的促生長作用最為明顯，而5.0%SBOS對乳酸桿菌的促生長作用最佳。提示SBOS改善腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的作用具有劑量效應(yīng)。

綜上所述，SBOS可增加香豬腸道菌群的多樣性，有效抑制了大腸桿菌、鏈球菌等有害菌的繁殖，促進(jìn)了雙歧桿菌等有益菌群的增殖。

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Effects of Soybean Oligosaccharides on Intestinal Microbes in vitro

ZHOU Xiaoli1,2, KONG Xiangfeng2,3,*
(1.Food and Pharmceutical Engineering Institute, Guiyang University, Guiyang 550005, China; 2. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China; 3. Research Center of Mini-Pig, Huanjiang Observation and Research Station for Karst Ecosystems, Chinese Ac ademy of Sciences, Huanjiang 547100, China)

This study was conducted to investigate the effects of soybean oligosaccharides (SBOS) on intestinal microbesin vitro. Jejunum, ileum and cecal digesta collected from Huanjiang mini-pigs were used as the inoculum, and SBOS atdifferent concentrations namely 0, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 5.0%and 8.0%, and 2.0%glucose were used as the substrates duringthein vitrofermentation. The slurry was fermented for 48 h in an anaerobicin vitrosystem, and then the intestinal microbeswere determined by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and real time-polymerase chain reaction(RT-PCR) techniques. The results showed that SBOS increased the intestinal microbial diversity when compared with thecontrol group. With increasing addition of SBOS, the beneficial bacteria were increased firstly and then decreased, whilethe bacterial pathogens were suppressed firstly and then enriched; 2.0%of SBOS, the optimal level, increased (P＜ 0.05)Bifidobacteriumin ileum and cecum, but decreased (P＜ 0.05)EscherichiaandStreptococcusin cecum when compared withthe glucose group. These findings suggested that 2.0%SBOS could enrich beneficial intestinal microbes, but suppressedbacterial pathogens in Huanjiang mini-pigs, which could effectively promote the diversity of the intestinal flora.

soybean oligosaccharides; fermentation; intestinal microbes

TS218；R151.3

1002-6630（2015）11-0157-05

10.7506/spkx1002-6630-201511030

2014-06-30

中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAC17B0102）

周笑犁（1985—），女，講師，博士，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：lizi008009@126.com

*通信作者：孔祥峰（1974—），男，研究員，博士，主要從事單胃動物腸道微生態(tài)研究。E-mail：nnkxf@isa.ac.cn