張 華，周志欽，席萬鵬,*

15 種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)的體外抗氧化活性比較

張 華1,2，周志欽1,3，席萬鵬1,3,*

（1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400716；2.重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶 404100；3.南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

為了明確柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)單體的抗氧化活性差異，利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzthiozoline-6）-sulphonic acid，ABTS）法、鐵離子還原（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法3種離線法，以及兩種在線高效液相色譜-DPPH/ABTS（high performance liquid chromatography-DPPH/ABTS，HPLC-DPPH/ABTS）柱后衍生系統(tǒng)聯(lián)用技術(shù)分別對(duì)15種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)單體的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定和比較分析。結(jié)果表明：抗氧化活性綜合（antioxidant potency composite，APC）指數(shù)可有效反應(yīng)各單體的抗氧化活性，柑橘果實(shí)15種主要酚類物質(zhì)抗氧化活性明顯不同，4種酚酸的抗氧化活性最強(qiáng)，依次為：沒食子酸（92.32%）＞咖啡酸（85.29%）＞綠原酸（69.75%）＞阿魏酸（50.97%）。圣草酚（39.38%）、圣草次苷（39.36%）和蘆?。?7.42%）的抗氧化活性中等，橙皮素、柚皮素、地奧司明、橙皮苷、川陳皮素、甜橙黃酮、柚皮苷和橘皮素的抗氧化活性較?。ǎ?%）。酚羥基的糖基化或甲基化會(huì)都降低柑橘酚類物質(zhì)的自由基清除能力，酚羥基數(shù)目越多，抗氧化活性越強(qiáng)。

酚酸；黃烷酮；抗氧化活性；DPPH法；ABTS法；鐵離子還原法；高效液相色譜-柱后衍生系統(tǒng)聯(lián)用技術(shù)

酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的最主要類型之一，目前已經(jīng)在植物界鑒定到8 000種以上。酚類物質(zhì)是具有一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)連接一個(gè)或多個(gè)羥基的一組化合物，主要由生物類黃酮、酚酸和單寧等三大類物質(zhì)構(gòu)成，各大類又由許多亞類物質(zhì)組成[1]。柑橘是世界上第一大水果，其果實(shí)具有重要的營養(yǎng)、保健和醫(yī)學(xué)價(jià)值?，F(xiàn)有的流行病學(xué)研究表明，柑橘果實(shí)的營養(yǎng)保健價(jià)值與其豐富的酚類物質(zhì)抗氧化活性密切相關(guān)[2]。柑橘果實(shí)中的酚類物質(zhì)主要包括黃烷酮、多甲氧基黃酮和酚酸，其中包括橙皮素、柚皮素在內(nèi)的15種酚類物質(zhì)被認(rèn)為在柑橘各代表類型的果實(shí)中廣泛存在[3-4]。盡管目前已有研究報(bào)道了寬皮柑橘[5]、柚、酸橙[6]、甜橙、檸檬[7-9]的抗氧化活性，但大多數(shù)研究主要集中評(píng)價(jià)柑橘各代表類型或品種中酚類物質(zhì)的總抗氧化活性上，目前，關(guān)于柑橘酚類物質(zhì)單體抗氧化活性的相關(guān)研究仍比較少見，相關(guān)信息還比較缺乏。

抗氧化活性測(cè)定方法可分為體外和體內(nèi)抗氧化方法或在線和非在線抗氧化方法等。體外抗氧化方法具有實(shí)驗(yàn)操作簡單方便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為普遍。體外抗氧化活性表現(xiàn)為抗氧化物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，以及對(duì)于金屬離子的還原能力。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzthiozoline-6）-sulphonic acid，ABTS）法和鐵離子還原（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）法是3種常用體外抗氧化活性檢測(cè)方法（“非在線”法）。隨著高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）的不斷發(fā)展，HPLC-DPPH和HPLC-ABTS聯(lián)用技術(shù)（“在線”法）不僅可以用于分離分析提取物中成分和化合物的含量，還可在線快速分析單個(gè)化合物的抗氧化活性[10]。“非在線”法化學(xué)反應(yīng)時(shí)間充分，可以從反應(yīng)程度說明物質(zhì)抗氧化活性強(qiáng)弱；“在線”法化學(xué)反應(yīng)時(shí)間較短，則是從化學(xué)反應(yīng)速率角度說明抗氧化活性強(qiáng)弱。但是，由于各種方法反應(yīng)原理和條件不同，測(cè)定的結(jié)果并不完全一致，需要同時(shí)配合使用才可以提高評(píng)價(jià)的可靠性和準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)使用ABTS法、DPPH法、FRAP法3種離線方法和HPLC-ABTS和HPLC-DPPH兩種在線體外評(píng)價(jià)方法，對(duì)15種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)單體的抗氧化活性進(jìn)行比較分析和綜合評(píng)價(jià)，旨在為柑橘資源的開發(fā)利用提供信息。

1 材料與方法

1.1試劑與材料

酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單體：柚皮苷（純度98%）、橙皮苷（純度98.0%）、橙皮素（純度97%）、圣草次苷（純度98%）、蘆丁（純度99%）、地奧司明（純度97.3%）、川陳皮素（純度98%）、甜橙黃酮（純度98.7%）、橘皮素（純度98.1%）、阿魏酸（純度99%）、沒食子酸（純度99%）、綠原酸（純度98%）北京百靈威公司；圣草酚（純度≥95.0%）、柚皮素（純度95%）、咖啡酸（純度≥98%）美國Sigma公司。15種常見酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)詳細(xì)信息見表1。

表1 15 種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)單體Table 1 Fifteen major phenolic monomers in citrus fruits

VC（L-ascorbic acid，純度99%）北京百靈威公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、DPPH、ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）、色譜級(jí)甲酸美國Sigma公司；無水乙醇、冰醋酸、醋酸鈉、氯化鐵、NaHCO3等為分析純天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2儀器與設(shè)備

Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)雙蒸水制備儀美國密理博公司；電子天平（感量0.1 mg）德國賽多利斯集團(tuán)；KQ-100B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；LDL-5A菲恰爾離心機(jī)上海菲恰爾分析儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)美國鉑金埃爾默公司。

Waters e2695型高效液相色譜分析系統(tǒng)（配有四元梯度泵、Waters XTerra MS C18保護(hù)柱（20 mm×3.9 mm，5 ?m）、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Waters 2998型光電二極管陣列PAD檢測(cè)器）、Waters柱后反應(yīng)系統(tǒng)（配有柱后衍生泵、柱后反應(yīng)線圈、柱后衍生反應(yīng)溫度控制器、Waters 2489雙通道紫外-可見光檢測(cè)器）、Waters EmpowerTM2 Chromatography數(shù)據(jù)分析工作站美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取15種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品單體固體粉末各10.00 mg，分別用DMSO溶解并定容至10.00 mL，配成1.00 mg/mL酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)貯備液，保存在-20℃冰箱中。

DPPH自由基溶液的配制：分別稱取0.019 6 g DPPH粉末于500 mL甲醇溶液中，配制為0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

ABTS+·溶液的配制：5 mL ABTS（7 mmol/L）溶液和88 ?L過磷酸鉀水溶液（140 mmol/ L），混合避光反應(yīng)12 h，得ABTS+·。取1 mL ABTS+·反應(yīng)液加入100 mL無水乙醇，然后用無水乙醇逐級(jí)稀釋至該溶液在400 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。ABTS+·反應(yīng)液在24 h之內(nèi)用完。

1.3.2單體抗氧化活性的非在線測(cè)定

DPPH自由基抗氧化活性測(cè)定參照Brand-Williams等[11]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確吸取50 ?L 1 mg/mL的酚類物質(zhì)單體貯備液于玻璃試管中，之后加入3.0 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液。將混合好的待測(cè)溶液，充分混勻，室溫下避光靜置30 min。測(cè)定517 nm波長處酚類物質(zhì)吸光度，吸光度越低，表明樣品抑制或清除自由基能力越強(qiáng)。添加等量的DMSO溶液作為空白對(duì)照組。每個(gè)分析樣品重復(fù)3次。按照下式計(jì)算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：Ai為空白對(duì)照組的吸光度；Aj為加樣品溶液的吸光度。

ABTS+·抗氧化活性的測(cè)定參照Arnao等[12]的方法，稍作修改。準(zhǔn)確吸取50 ?L 1 mg/mL的酚類物質(zhì)單體貯備液，加入3 mL已經(jīng)預(yù)先混合的ABTS反應(yīng)試劑，充分混勻，室溫反應(yīng)10 min，在400 nm波長處測(cè)定吸光度。添加等量的DMSO溶液作為空白對(duì)照組。每個(gè)分析樣品重復(fù)3 次。按照下式計(jì)算樣品的ABTS+·抑制率。

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；At為樣品溶液吸光度。

樣品的FRAP值測(cè)定參照Benzie等[13]的方法。取50 ?L提取物，加入3 mL已經(jīng)預(yù)先混合的FRAP反應(yīng)試劑（0.1 mol/LpH 3.6醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L氯化鐵以體積比10∶1∶1混合）。超聲波振蕩30 s，反應(yīng)10 min，混合均勻后在593 nm波長處測(cè)定吸光度。以VC水溶液為標(biāo)樣，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度（y）與VC含量（x）之間的回歸方程。樣品的FRAP值（還原Fe3+的抗氧化活性）用VC當(dāng)量抗氧化能力（ascorbic acid equivalent antioxidant capacity，AAEAC）來表示（mg/L）。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3 HPLC-DPPH/ABTS抗氧化活性的在線測(cè)定

HPLC系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置參考張?jiān)返萚3]已經(jīng)報(bào)道的方法（略有改動(dòng)）。Sunfire-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序條件：0～20 min 37%～50%B；20～35 min 50%～80%B；35～40 min 80%～100%B；40～50 min 100%B；50～60 min 37%B，流速0.7 mL/min；柱溫25℃；進(jìn)樣體積15 ?L；檢測(cè)波長設(shè)置為283、280、330、367、290、320 nm。同時(shí)進(jìn)行200～600 nm全波段光譜掃描。

柱后衍生自由基分析系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置參見Jeon等[14]的方法，略有改動(dòng)。0.1 mmol/L DPPH自由基溶液引入流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長517 nm；ABTS·+溶液（400 nm波長處吸光度為0.70±0.02），引入流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長400 nm，柱后溫度25℃。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和皮爾森相關(guān)性分析。采用Origin 7.5作圖軟件作圖。所得數(shù)據(jù)用±s的形式表示。使用抗氧化活性綜合（antioxidant potency composite，APC）指數(shù)法[15]進(jìn)行酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單體抗氧化活性比較，按照下式計(jì)算APC指數(shù)。

ABTS+·抑制率/%=

2 結(jié)果與分析

2.1基于DPPH法、ABTS法和FRAP法酚類物質(zhì)單體抗氧化活性分析

表2 15種常見柑橘酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的抗氧化活性Table 2 Antioxidant capacities of 15 major phenolics in citrus fruits

由表2可知，由DPPH法和ABTS法測(cè)定的15種酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除率和ABTS+·的抑制率明顯不同。在DPPH自由基捕獲法中，15種酚類物質(zhì)抑制DPPH自由基清除效果由大到小的順序依次是：咖啡酸（（32.47±5.96）%）和沒食子酸（（32.52±2.40）%）＞綠原酸（（26.67±2.42）%）＞圣草酚（（19.24± 2.34）%）＞阿魏酸（（17.36±1.32）%）＞蘆丁（（15.06± 2.21）%）＞其他酚類物質(zhì)。3 種多甲氧基黃酮（川陳皮素、甜橙黃酮和橘皮素）的DPPH自由基清除率均較低。其中測(cè)得酚類物質(zhì)的DPPH自由基清除率最高值（沒食子酸，（32.52±2.40）%）是最低值（柚皮苷，（0.52±0.24）%）的62.54 倍。

在ABTS+·捕獲法中，15 種酚類物質(zhì)對(duì)ABTS+·的抑制效果由大到小的順序依次是：沒食子酸（（62.16±4.48）%）＞阿魏酸（（57.24±1.36）%）＞咖啡酸（（25.69±2.41）%）＞圣草酚（（17.39±3.23）%）＞圣草次苷（（16.53±8.79）%）＞綠原酸（（16.06±1.21）%）＞蘆丁（（13.04±1.77）%）＞橙皮素（（11.39±3.00）%）＞柚皮素（（10.98±0.95）%）＞橙皮苷（（5.97± 2.36）%）＞地奧司明（（5.71±2.58）%）＞柚皮苷（（2.61±0.95）%）＞甜橙黃酮（（0.99±0.10）%）＞川陳皮素（（0.99±1.84）%）＞橘皮素（（0.21±1.69）%）。其中測(cè)得酚類物質(zhì)的ABTS+·抑制率最高值（沒食子酸（62.16±4.48）%）是最低值（橘皮素（0.21±1.69）%）的296 倍。

在F R A P法測(cè)定方法中，1 5種酚類物質(zhì)還原F e3+的抗氧化活性由大到小的順序依次是：沒食子酸（（1 175.33±18.33）mg/L）＞咖啡酸（（1 002.29±32.50）mg/L）＞綠原酸（（876.22±26.89）mg/L）＞阿魏酸（（734.02± 17.47）mg/L）＞圣草次苷（（283.92±3.83）mg/L）＞圣草酚（（96.89±4.56）mg/L）＞蘆?。ǎ?8.97±3.24）mg/L）＞柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、地奧司明、川陳皮素、甜橙黃酮和橘皮素（均未檢測(cè)到抗氧化活性）。其中沒食子酸（（1 175.33±18.33）mg/mL）的FRAP值是蘆?。ǎ?8.97±3.24）mg/L）FRAP值的61.96倍。

2.2基于在線HPLC-DPPH/ABTS法酚類物質(zhì)單體的抗氧化活性分析

在線HPLC-DPPH/ABTS抗氧化活性檢測(cè)系統(tǒng)由HPLC系統(tǒng)和柱后衍生系統(tǒng)組成。HPLC系統(tǒng)用來檢測(cè)有無酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)從色譜柱中被洗脫出來，如果相對(duì)于空白樣品檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)到有正色譜峰說明有酚類物質(zhì)被洗脫出來；反之則沒有。柱后系統(tǒng)用來檢測(cè)DPPH自由基溶液或者是ABTS+·溶液的光吸收響應(yīng)值，在進(jìn)樣品之前，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)將DPPH自由基溶液或ABTS+·溶液的光吸收數(shù)值歸零。當(dāng)有抗氧化物質(zhì)清除掉DPPH自由基或ABTS+·時(shí)候，柱后系統(tǒng)便會(huì)檢測(cè)出倒峰，色譜倒峰面積越大，代表其抗氧化活性越強(qiáng)。由表2可知，在1～8號(hào)生物類黃酮中，只有圣草酚、圣草次苷和蘆丁檢測(cè)出色譜倒峰。在9～11號(hào)3種多甲氧基黃酮均未檢測(cè)出倒峰。12～15號(hào)4種酚類物質(zhì)均檢測(cè)出倒峰。HPLC-DPPH法測(cè)定的倒峰面積明顯小于HPLC-ABTS法測(cè)得的峰面積。

利用HPLC-DPPH在線法檢測(cè)酚類物質(zhì)的倒峰面積由大到小的順序是：咖啡酸（（36.90±1.24）×105）＞綠原酸（（32.18±0.33）×105）＞沒食子酸（（29.43±1.12）×105）＞圣草酚（（8.34±1.03）×105）＞阿魏酸（（5.86±0.09）×105）＞蘆?。ǎ?.61±0.26）×105）＞圣草次苷（（5.28±0.20）×105）。HPLCDPPH在線法測(cè)得的倒峰面積最大值（咖啡酸（36.90±1.24）×105）是最小值（圣草次苷（5.28±0.20）×105）的6.99倍。

利用HPLC-ABTS在線法檢測(cè)出酚類物質(zhì)的倒峰面積由大到小的順序是：咖啡酸（（31.05±2.85）×106）和圣草次苷（（29.16±1.36）×106）＞沒食子酸（（25.42±3.15）×106）、圣草酚（（24.51±0.70）×106）和綠原酸（（24.58±0.23）×106）＞蘆?。ǎ?6.46±0.76）×106）＞阿魏酸（（9.64±0.12）×106）。HPLC-ABTS在線法測(cè)得的倒峰面積最大值（咖啡酸（31.05±2.85）×106）是最小值（阿魏酸（9.64±0.12）×106）的3.22倍。

2.3酚類物質(zhì)單體的抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

圖1 15 種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)抗氧化活性APC指數(shù)Fig.1 APC indexes for antioxidant activities of 15 major phenolics in citrus fruits

表3 15 種柑橘果實(shí)主要酚類物質(zhì)抗氧化活性及排序Table 3 Ranking of 15 major phenolic compounds in citrus fruits by antioxidant activviittyy

由于各種化合物化學(xué)性質(zhì)不同，且各種方法反應(yīng)原理和條件也存在差異，因此，使用各種方法測(cè)定得到的抗氧化活性結(jié)果并不完全一致。如果能將各種測(cè)定方法的抗氧化活性結(jié)果綜合起來，即可直接比較各種化合物的抗氧化活性差異[16-17]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)Seeram等[15]報(bào)道的APC指數(shù)法對(duì)5種測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)（圖1和表3）。結(jié)果顯示，APC指數(shù)由大到小的順序是：沒食子酸（92.32%）＞咖啡酸（85.29%）＞綠原酸（69.75%）＞阿魏酸（50.97%）＞圣草酚（39.38%）＞圣草次苷（39.36%）＞蘆?。?7.42%）＞橙皮素（4.88%）＞柚皮素（4.78%）＞地奧司明（3.24%）＞橙皮苷（2.33%）＞川陳皮素（1.18%）＞甜橙黃酮（1.16%）、柚皮苷（1.16%）＞橘皮素（0.41%）。其中沒食子酸的APC指數(shù)（92.32%）最高，是橘皮素APC指數(shù)（0.41%）的225.17倍。APC指數(shù)顯示排在前4位的都是酚酸，多甲氧基黃酮排在較后位置。未糖基化的黃酮類APC指數(shù)要大于糖基化的黃酮類化合物。

3 討 論

大量研究表明，植物酚類物質(zhì)具有抗氧化活性，能有效清除自由基，還原金屬離子[2]。目前，少數(shù)柑橘酚類物質(zhì)的抗氧化活性也已有報(bào)道，胡春等[18]發(fā)現(xiàn)橙皮苷具有清除羥自由基的作用。葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中的柚皮素和柚皮苷均有一定的抗氧化活性[19-22]。本研究結(jié)果表明，柑橘果實(shí)15種主要酚類化合物均都具有清除自由基和還原金屬離子的能力（表1），各單體化合物抗氧化活性差異較大，依次為：沒食子酸＞咖啡酸＞綠原酸＞阿魏酸＞圣草酚＞圣草次苷＞蘆丁＞橙皮素＞柚皮素＞地奧司明＞橙皮苷＞川陳皮素＞甜橙黃酮＞柚皮苷＞橘皮素。孫麗萍等[23]對(duì)山奈酚、咖啡酸、異鼠李素、綠原酸、高良姜素和對(duì)香豆酸6種化合物的抗氧化活性進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示抗氧化活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋荷侥畏樱究Х人幔井愂罄钏兀揪G原酸＞高良姜素＞對(duì)香豆酸。與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的咖啡酸抗氧化活性高于綠原酸抗氧化活性的結(jié)果相一致。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，14種野生寬皮柑橘果肉的抗氧化活性與總酚酸含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01，DPPH：r= 0.843；FRAP：r= 0.917；ABTS：r= 0.907；氧自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）：r=0.885），而與總黃酮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，DPPH：r= 0.643；FRAP：r= 0.638；ABTS：r=0.573；ORAC：r= 0.596），總酚酸含量高的品種其總抗氧化活性也顯著高于其他品種[24]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的4種酚酸單體的抗氧化活性顯著高于其他類黃酮的結(jié)果相一致。阿魏酸是14種野生寬皮柑橘果肉的主要酚酸，阿魏酸含量高的品種抗氧化活性也顯著高于其他品種，這主要是由于果實(shí)的總抗氧化活性不僅與酚類化合物的抗氧化活性有關(guān)，而且與其在果實(shí)中的絕對(duì)含量也直接相關(guān)。

現(xiàn)有研究表明，植物酚類化合物的抗氧化活性差異不僅與酚羥基的糖基化、甲氧化以及酚羥基的數(shù)目和取代位置相關(guān)，也與C2、C3位雙鍵的有無相關(guān)[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖基化的酚類物質(zhì)的抗氧化活性均低于相對(duì)應(yīng)的酚類物質(zhì)糖基配苷。如柚皮苷、橙皮苷和圣草次苷分別是柚皮素、橙皮素和圣草酚C7位羥基糖基化的產(chǎn)物，即糖基化的類黃酮抗氧化活性要小于相對(duì)應(yīng)的糖基配苷。侯留鑫等[26]的研究結(jié)果顯示，柚皮素的抗氧化活性顯著大于柚皮苷。綠原酸與咖啡酸的不同在于咖啡酸的羧基被糖基化即為綠原酸，其抗氧化活性強(qiáng)于綠原酸，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。蔣柳云等[27]的報(bào)道顯示，黃酮苷的抗氧化活性隨著糖基中糖的增多而減小。侯留鑫等[26]的研究也證明了黃酮苷元的抗氧化活性大于黃酮糖苷，黃酮二糖苷的抗氧化活性大于黃酮四糖苷。有研究表明，黃酮類化合物羥基成苷后，原分子會(huì)失去絡(luò)合過渡金屬離子的能力，從而不能有效絡(luò)合可以催化過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一些重要金屬離子，造成抗氧化活性降低[28]。

酚類物質(zhì)羥基甲氧基化也會(huì)直接影響其抗氧化活性。川橙皮素、甜橙黃酮和橘皮素均屬于多甲氧基黃酮。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是苯環(huán)上的羥基高度甲氧基化，沒有酚羥基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種多甲氧基黃酮抗氧化活性均較差。這可能是由于黃酮類化合物甲氧基化后，原分子氧糖苷的形成改變了分子的平面結(jié)構(gòu)和親脂性所致[29]。單楊等[30]研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)羥基甲氧基化會(huì)降低酚類化合物的抗氧化活性。同時(shí)，羥基的糖基化或甲氧基化造成羥基數(shù)目的減少，也會(huì)降低其抗氧化活性[1]。如圣草酚的B環(huán)上有兩個(gè)羥基，橙皮素和柚皮素的B環(huán)上有一個(gè)酚羥基，圣草酚的抗氧化活性強(qiáng)于橙皮素和柚皮素。其原因?yàn)榉恿u基越多，則與活性自由基結(jié)合的氫原子也越多。當(dāng)酚羥基與自由基結(jié)合后，由于羥基中氧原子的pπ共軛效應(yīng)具有強(qiáng)烈的斥電子作用，使得與活性自由基反應(yīng)后生成的酚類自由基更穩(wěn)定[31]，從而有利于清除自由基。

現(xiàn)有研究表明，黃酮類化合物B環(huán)上的羥基是黃酮類化合物抗氧化、清除自由基的主要活性部位[32]。本研究中，圣草酚B環(huán)上的鄰二酚羥基表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，黃酮類化合物A環(huán)上C7位酚羥基也是一個(gè)重要的抗氧化活性基團(tuán)。C7位酚羥基糖基化的柚皮苷、橙皮苷和圣草次苷與未糖基化的柚皮素、橙皮素和圣草酚相比，其抗氧化明顯降低。黃酮類化合物C環(huán)上的C3位的羥基似乎對(duì)抗氧化活性不大。蘆丁C3位具有糖基，但是蘆丁仍然具有較強(qiáng)的抗氧化活性。這和Cholbi等[33]的研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)镃3是醇羥基，其與酚羥基相比較穩(wěn)定，不易失電子，可增加化合物的水溶性而對(duì)抗氧化活性意義不大。C2、C3位雙鍵對(duì)抗氧化活性的影響說法不一。理論上分析，雙鍵延長了共軛體系，有利于B環(huán)失電子后自旋形成更穩(wěn)定的自由基從而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。而一旦雙鍵被氫化后，縮短了共軛體系，改變了分子的平面結(jié)構(gòu)，降低了羥基的作用，黃酮類物質(zhì)的抗氧化活性會(huì)降低。本研究發(fā)現(xiàn)，地奧司明和橙皮苷兩者抗氧化活性差異不顯著，證明C2和C3位雙鍵的有無對(duì)黃酮類化合物抗氧化活性影響不大，這與Husain等[31]的研究結(jié)果相一致。Mora等[34]研究指出，芹菜素C2、C3位雙鍵氫化為柑橘素后，抗氧化活性下降很大，雙鍵對(duì)活性影響較大。

4 結(jié) 論

柑橘果實(shí)酚類物質(zhì)的抗氧化活性明顯不同，在檢測(cè)的15種柑橘主要酚類物質(zhì)中，沒食子酸、咖啡酸、綠原酸和阿魏酸4種酚酸的抗氧化活性最強(qiáng)，圣草酚、圣草次苷和蘆丁的抗氧化活性中等，橙皮素、柚皮素、地奧司明、橙皮苷、川陳皮素、甜橙黃酮、柚皮苷和橘皮素的抗氧化活性最低，柑橘酚類化合物的抗氧化活性差異主要與酚羥基的結(jié)構(gòu)修飾密切相關(guān)。

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Comparison of Antioxidant Activity in vitro of 15 Major Phenolic Compounds in Citrus Fruits

ZHANG Hua1,2, ZHOU Zhiqin1,3, XI Wanpeng1,3,*(1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404100, China; 3. Key Laboratory of Horticulture for Southern Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715, China)

The antioxidant activities of 15 major phenolic compounds in citrus were evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid (ABTS) radical scavenging capacity and ferric reducing/antioxidant power (FRAP) assays alone and in combination with high performance liquid chromatography-DPPH/ABTS (HPLC-DPPH/ABTS) post-column reaction system. The results showed that the antioxidant potency composite (APC) index was a valid comprehensive index for evaluating antioxidant activities of phenolic compounds, and an obvious difference in antioxidant activities of these major phenolic compounds was observed. Four phenolic acids had the highest antioxidant activities in the declining order of gallic acid (92.32%) ＞ caffeic acid (85.29%) ＞ chlorogenic acid (69.75%) ＞ ferulic acid (50.97%), eriodictyol (39.38%), eriocitrin (39.36%) and rutin (27.42%) were in the middle, and the antioxidant activities of hesperitin, naringenin, diosmin, hesperidin, nobiletin, sinensetin, naringin and tangeretin (＜ 5%) were very low. The antioxidant activities of these phenolic compounds were reduced by glycosylation or methoxylation, but increased with increasing number of phenolic hydroxyl groups.

phenolic acid; flavanone; antioxidant activity; DPPH method; ABTS method; FRAP method; HPLC-DPPH/ABTS

TS201.4

1002-6630（2015）11-0064-07

10.7506/spkx1002-6630-201511013

2014-11-01

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2014A014）；重慶三峽學(xué)院引進(jìn)高層次人員科研啟動(dòng)項(xiàng)目（14RC05）；重慶市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（cstc2013jcyjA80012）

張華（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)楣窢I養(yǎng)與安全。E-mail：zhanghua03129@163.com

*通信作者：席萬鵬（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楣菲焚|(zhì)與營養(yǎng)。E-mail：xwp1999@zju.edu.cn