唐明禮，王 勃，劉 賀，何余堂，惠麗娟，馬 濤*

煎餅發(fā)酵面糊中優(yōu)勢菌種的篩選與鑒定

唐明禮，王 勃，劉 賀，何余堂，惠麗娟，馬 濤*

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧 錦州 121013）

對煎餅發(fā)酵面糊中的優(yōu)勢菌種進(jìn)行富集培養(yǎng)和劃線分離，通過菌落形態(tài)、顏色、大小等進(jìn)行初篩，通過生理生化實(shí)驗(yàn)、耐受性實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行復(fù)篩，采用VITEC-2 Compact微生物鑒定儀對其進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果表明：從煎餅發(fā)酵面糊中分離篩選得到的9 株乳酸菌和11 株酵母菌中，乳酸菌R2、R8和酵母菌Y8發(fā)酵性能良好，經(jīng)鑒定R2為腸膜明串珠菌、R8為戊糖片球菌、Y8為釀酒酵母，可以作為煎餅專用復(fù)合發(fā)酵劑用菌。

煎餅面糊；乳酸菌；酵母菌；篩選；鑒定

煎餅是一種很受歡迎的全谷物制品，隨著消費(fèi)者健康意識的增強(qiáng)，一些流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)全谷物中含有多種營養(yǎng)成分以及生物活性物質(zhì)，如膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等[1]，攝入全谷物食品也可預(yù)防癌癥、心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等[2]。煎餅發(fā)酵面糊是由五谷雜糧研磨經(jīng)過乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵而成，面糊中菌群的種類及數(shù)量會影響產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、老化、營養(yǎng)價值、貨架期等[3]。煎餅的傳統(tǒng)生產(chǎn)主要利用面糊及環(huán)境中的乳酸菌和酵母菌自然發(fā)酵進(jìn)行攤制，但生產(chǎn)過程易受微生物二次污染、質(zhì)量安全令人堪憂等問題將被煎餅專用復(fù)合發(fā)酵劑取代。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）通過產(chǎn)生乳酸、醋酸、乙醇、芳香化合物、細(xì)菌素、胞外多糖等來提高產(chǎn)品的貨架壽命、微生物安全，改善產(chǎn)品的感官品質(zhì)[4-5]。LAB也是重要的工業(yè)發(fā)酵劑，其蛋白水解系統(tǒng)能將蛋白質(zhì)水解為氨基酸和小分子肽，這可促進(jìn)其他微生物的生長及代謝，能增強(qiáng)風(fēng)味物質(zhì)的形成及改善面糊的流變學(xué)性質(zhì)[6-7]，可應(yīng)用在酸奶、奶酪、香腸、酸菜、酸面團(tuán)等發(fā)酵食品的生產(chǎn)[8]。酵母菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生二氧化碳及醇類、醛類、酯類和酮類等芳香族化合物[9]，使發(fā)酵產(chǎn)品具有良好的感官品質(zhì)和獨(dú)特的香味。發(fā)酵劑是傳統(tǒng)產(chǎn)品的連續(xù)化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的靈魂所在，可使地方特色產(chǎn)品區(qū)域化、全國化等。通過復(fù)合菌種制作的煎餅，不僅提高發(fā)酵時間、生產(chǎn)效率而且也提高了食用安全性。

傳統(tǒng)表型方法如使用碳水化合物發(fā)酵的生化及形態(tài)特征對菌種的鑒定，具有較差的重現(xiàn)性及較低的分辨率[10-11]，快速、方便、可靠的鑒定技術(shù)勢在必行。VITEC-2 Compact微生物鑒定儀自動化程度高、檢測時間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)已成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室鑒定菌株的有力工具[12-13]。本實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容是從自然發(fā)酵煎餅面糊中篩選優(yōu)質(zhì)乳酸菌和酵母菌，并使用VITEC-2 Compact微生物鑒定儀對其進(jìn)行鑒定，旨在為煎餅的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，同時也豐富了發(fā)酵面制品的菌種資源。

1 材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

菌種：乳酸菌為戊糖片球菌(P e d i o c o c c u s pentosaceus）和腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），酵母菌為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），從煎餅發(fā)酵面糊中分離并由實(shí)驗(yàn)室保藏；煎餅發(fā)酵面糊（pH 4.0，乳酸菌：8.7×107CFU/g，酵母菌：5.8×107CFU/g，發(fā)酵時間：10 h） 本溪寨香生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、YEPD培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；YEPD液體培養(yǎng)基為每1 000 mL培養(yǎng)基酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，pH 6.0；GP卡片、YST卡片（法國梅里埃公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEC-2 Compact全自動微生物鑒定儀 法國梅里埃公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；GMSX-280手提式壓力蒸汽滅菌器 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；HS-1300無菌操作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市鑫鑫試驗(yàn)儀器廠；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的分離與純化

用無菌生理鹽水對煎餅發(fā)酵面糊進(jìn)行稀釋，將不同稀釋度的面糊分別接種在用于分離乳酸菌的MRS培養(yǎng)基和分離酵母菌的YEPD培養(yǎng)基中，36 ℃和28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～36 h，根據(jù)菌落的顏色、直徑和表面特征等挑取單菌落，多次劃線提純直至菌落較純，得到純菌落后進(jìn)行復(fù)篩及鑒定[14-17]。

1.3.2菌種的復(fù)篩

1.3.2.1乳酸菌產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

挑取分離純化后的乳酸菌以2%的接種量加入250 mL的MRS液體培養(yǎng)基中36 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h用pH計測定發(fā)酵液pH值。

1.3.2.2酵母菌的產(chǎn)氣性能實(shí)驗(yàn)

將初篩后的酵母菌接種于YEPD含有杜式發(fā)酵管的液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測定酵母菌株的起酵時間、產(chǎn)氣泡的快慢、杜氏管滿時間，比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵性能，篩出性能優(yōu)良的酵母菌[18-19]。

1.3.2.3菌株的生長曲線

將分離的菌株以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于250 mL的液體培養(yǎng)基中，乳酸菌在36 ℃、酵母菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h取出培養(yǎng)液，以未接種的培養(yǎng)基為空白對照。分別在波長600 nm和660 nm處測量光密度（OD）值，以時間為橫坐標(biāo)，菌液OD值為縱坐標(biāo)，觀察菌株的生長曲線[20-22]。

1.3.2.4菌株的耐受性實(shí)驗(yàn)

將乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基，酒精的添加體積分?jǐn)?shù)為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，溫度為20、25、30、35、40 ℃。滅菌后，按2%接種量接入活化好的乳酸菌，培養(yǎng)16 h，以未接種的空白培養(yǎng)基為對照，取出培養(yǎng)液測定OD600nm值。以溫度、酒精體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，菌液OD600nm值為縱坐標(biāo)，觀察乳酸菌的生長曲線?？疾旄骶陮凭囟鹊哪褪苄?，篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌作為發(fā)酵劑。

將酵母菌接入YEPD液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為2.5、3、3.5、4、4.5、溫度為20、25、30、35、40℃。滅菌后，按2%接種量接入活化好的酵母菌，培養(yǎng)14 h，以未接種的空白培養(yǎng)基為對照，取出培養(yǎng)液測定OD660nm值。以溫度、pH值為橫坐標(biāo)，菌液OD660nm值為縱坐標(biāo)，觀察酵母菌的生長曲線。考察各菌株對pH值、溫度耐受性，篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌作為發(fā)酵劑[23]。

1.3.3煎餅發(fā)酵面糊中優(yōu)勢菌種的鑒定

將篩選出的菌株培養(yǎng)懸浮于0.45%的滅菌生理鹽水中，并用濁度儀確定乳酸菌的濁度為0.5～0.63，酵母菌的濁度為1.8～2.2，將懸浮液分別填充于GP和YST卡片中進(jìn)行鑒定。

1.4數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1煎餅發(fā)酵面糊中優(yōu)勢菌株的分離與純化

通過對煎餅發(fā)酵面糊中乳酸菌的培養(yǎng)及革蘭氏染色，從中分離出R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9，9株疑似乳酸菌，其菌落的顏色、直徑和表面特征見表1。從煎餅發(fā)酵面糊中分離出Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11共11株酵母菌，其酵母菌的菌落形態(tài)特征見表2。

表1 乳酸菌株的菌落形態(tài)特征Table1 Colony characteristics of LAB strains

表2 酵母菌的菌落形態(tài)特征Table2 Colony characteristics of yeast strains

2.2菌株的復(fù)篩

2.2.1乳酸菌的產(chǎn)酸速率

圖1為4株菌株24 h的pH值曲線變化情況，最初pH值為6.3～6.7，R1的pH值下降速率較緩慢，產(chǎn)酸能力較弱，其他菌株的pH值不斷下降，產(chǎn)酸曲線表現(xiàn)出基本相似的曲線。與其他乳酸菌相比，R2產(chǎn)酸速率較快，其最低pH值可達(dá)3.91。大多數(shù)的發(fā)酵食品如奶、肉、谷物等并不是無菌的，乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸和乙酸等有機(jī)酸，不僅可與酵母菌產(chǎn)生的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)可生成酯類等芳香物質(zhì)，使煎餅香氣濃郁外，也可抑制發(fā)酵過程中腐敗菌及致病菌的生長，提高煎餅的食用安全性。

圖1 乳酸菌產(chǎn)酸速率曲線Fig.1 Acid production curves for LAB

2.2.2酵母菌的產(chǎn)氣性能

Y1、Y2、Y4、Y8等酵母菌的產(chǎn)氣性能見表3，其余均為產(chǎn)氣。起酵時間和杜氏管管滿時間越短，發(fā)酵性能越強(qiáng)，越有利于煎餅生產(chǎn)的生產(chǎn)效率及成本。根據(jù)表3可知，4株酵母菌在起酵時間和杜氏管管滿時間均顯著性，Y8起酵時間及杜氏管管滿時間較短，從生產(chǎn)效率及成本考慮，選取Y8為煎餅復(fù)合發(fā)酵劑專用菌株。但酵母菌除產(chǎn)氣性能外，還會產(chǎn)生特定風(fēng)味成分，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)給予具體考慮。

表3 酵母菌的產(chǎn)氣性能Table3 Gas-generating properties of yeasts

表3 酵母菌的產(chǎn)氣性能Table3 Gas-generating properties of yeasts

菌株起酵時間/min杜氏管管滿時間/min產(chǎn)味類型Y2480.23±2.08a540.74±1.15a香甜Y4440.48±1.52b600.85±1.73b香甜Y8436.26±0.57c530.37±1.00c香甜Y9468.67±2.00d630.57±0.57d香甜

2.2.3 菌株的生長曲線

圖2a為乳酸菌的生長曲線，0～2 h內(nèi)5株菌生長較緩慢，在2～14 h內(nèi)所有菌株繁殖迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，OD600nm值持續(xù)上升，但R2的OD600nm值較大，最大可達(dá)2.98。說明R2不僅產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，且生長迅速。圖2b為酵母菌的生長曲線，同樣它們的延滯期也為2 h，在2～14 h內(nèi)所有菌株進(jìn)入對數(shù)生長期繁殖迅速，OD660nm值持續(xù)上升，Y8菌株OD660nm值較大，生長迅速。

圖2 乳酸菌（a）和酵母菌（b）的生長曲線Fig.2 Growth curves of LAB (a) and yeasts (b)

2.2.4菌株的耐受性

對于煎餅發(fā)酵劑的選擇不能僅立足于功能特性，而且要具備適應(yīng)不同環(huán)境的能力，通過發(fā)酵溫度、菌種添加量等環(huán)境條件的改變，可控制煎餅面糊的發(fā)酵時間，有利于煎餅的連續(xù)及淡旺季生產(chǎn)。所以對優(yōu)勢菌株耐受性的選擇是當(dāng)務(wù)之急。發(fā)酵溫度對面糊中優(yōu)勢菌的影響如圖3所示，溫度對菌種均有不同程度的影響，且隨溫度增加對其生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)。25～40℃，乳酸菌OD600nm值隨發(fā)酵溫度的增加而增加，菌株生長迅速，但45℃之后，溫度的提高抑制了菌株生長；酵母菌OD660nm值在20～35℃范圍內(nèi)與溫度成正比，酵母菌在40℃之后受到抑制，可能高溫導(dǎo)致了蛋白質(zhì)和變性。在整個生長過程中，乳酸菌R8和酵母菌Y8的OD值較大，受溫度的影響較小。

圖3 發(fā)酵溫度對面糊中優(yōu)勢乳酸菌（a）和酵母菌（b）菌株的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the dominant strains in batter

由于煎餅面糊是由酵母菌和乳酸菌共同發(fā)酵，酵母菌在代謝過程中產(chǎn)生酒精，所以酒精體積分?jǐn)?shù)會影響乳酸菌的生長，同時發(fā)酵過程中乳酸菌會使面糊的pH值降低，所以對乳酸菌進(jìn)行耐酒精篩選和對酵母菌進(jìn)行耐酸性篩選。由圖4可知，菌株的OD600nm值與酒精體積分?jǐn)?shù)成反比，但各菌株對酒精均有一定耐受力，當(dāng)酒精體積分?jǐn)?shù)為3%時，菌株的生長明顯受到抑制，但R8菌株對酒精的耐受性較其他菌株好。圖5為pH值對酵母菌的影響，隨pH值增加，酵母菌生長迅速，較低pH值時，所有酵母菌生長受到抑制，Y8菌株表現(xiàn)出良好的耐受性。根據(jù)以上菌株的耐受性，選取Y8和R8作為煎餅的混合直投式發(fā)酵劑。

圖4 酒精體積分?jǐn)?shù)對乳酸菌生長的影響Fig. 4 Effect of alcohol content on the growth of LAB

圖5 pH值對酵母菌生長的影響Fig.5 Effect of pH on the growth of yeast

2.3 VITEC-2 Compact全自動微生物鑒定儀對面糊中優(yōu)勢菌株的鑒定結(jié)果

由表4可知，使用濁度儀將乳酸菌的菌懸液濁度調(diào)為0.55，經(jīng)過5 h的分析鑒定，鑒定結(jié)果為R8是戊糖片球菌，可能性百分比為97%，R2是腸膜明串珠菌，可能性百分比為96%，具有良好的鑒定結(jié)果。表5為VITEC-2 Compact微生物鑒定儀對Y8酵母菌的鑒定結(jié)果。使用濁度儀將酵母菌的菌懸液濁度調(diào)為1.96，經(jīng)過18.25 h的鑒定，鑒定結(jié)果為釀酒酵母，可能性百分比為97%，具有良好的鑒定結(jié)果。

表4 VITEC-2 Compact全自動微生物鑒定儀對乳酸菌的生化反應(yīng)鑒定結(jié)果Table4 Identification of LAB by LAB VITEC-2 Compact automated microbial identification system

表5 VITEC-2 Compact全自動微生物鑒定儀對酵母菌生化反應(yīng)的鑒定結(jié)果Table5 Identification of yeasts by VITEC-2 Compact automated microbial identification system

3 結(jié) 論

從煎餅發(fā)酵面糊中分離出9種乳酸菌和11種酵母菌，R2菌株生長迅速，產(chǎn)酸、抗氧化能力較強(qiáng)，R8對溫度及酒精含量的耐受性較強(qiáng)，Y8菌株生長迅速，產(chǎn)氣性能好，對pH值和溫度的耐受性較強(qiáng)。綜上，選取R2、R8

和Y8作為煎餅的專用復(fù)合發(fā)酵劑。VITEC-2 Compact全自動微生物鑒定儀對篩選出的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果R2為腸膜明串珠菌、R8為戊糖片球菌、Y8為釀酒酵母。

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Screening and Identification of Dominant Strains in Fermented Pancake Batter

TANG Mingli, WANG Bo, LIU He, HE Yutang, HUI Lijuan, MA Tao*(Grain and Oil Science and Technology Institute, College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Microbial strains responsible for naturally fermented pancake flavor with local characteristics were isolatedand screened from fermented pancake batter for providing the basis for industrial production of traditional foods. Usingenrichment culture and plate streaking, the dominant species in fermented pancake batter were isolated. The initial screeningwas performed by colony morphology, color and size, and the secondary screening was performed by physiological andbiochemical tests, and tolerance test. The final isolates were identified by VITEC-2 compact microbial identification system.The results showed that nine strains of lactic acid bacteria and eleven strains of yeasts were obtained from fermentedpancake batter, and lactic acid bacteria R2and R8and yeast Y8, which had good fermentation performance, could be used asfermentation starters in combination for panckage batter. R2was identified asLeuconostoc mesenteroides, R8asPediococcuspentosaceus, and Y8asSaccharomyces cerevisiae.

pancake batter; lactic acid bacterium; yeast; screening; identification

TS201.3

1002-6630（2015）17-0207-05

10.7506/spkx1002-6630-201517039

2014-08-17

唐明禮（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：707334794@qq.com

*通信作者：馬濤（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z油與植物蛋白工程。E-mail：1040732408@qq.com