何 捷，曾小群,*，呂鳴春，毛仲瑄，王象林，潘道東

新疆酸奶中高產(chǎn)蛋白酶與產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的篩選

何 捷1，曾小群1,*，呂鳴春1，毛仲瑄1，王象林2，潘道東1

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 寧波 315211）

從新疆傳統(tǒng)酸奶中，利用透明圈法篩選出一株高產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌RA3，其蛋白酶活力為38.87 U/mL；利用銅皂法篩選出產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌菌株RC4，其酶活力為8.54 U/mL。經(jīng)API 50CHL生理生化實驗和16S rRNA序列比對鑒定RA3為發(fā)酵乳桿菌，RC4為植物乳桿菌，為我國發(fā)酵食品提供了新的乳酸菌資源。

乳酸菌；篩選；蛋白酶；脂肪酶

乳酸菌是一種具有營養(yǎng)作用、食療功效、醫(yī)療保健功能和安全性的益生菌。乳酸菌的蛋白酶可以分解蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生多肽、氨基酸，提高胃蛋白酶的活性，促進(jìn)損傷的腸黏膜上皮修復(fù)等[1]。乳酸菌蛋白酶活性作為影響乳酸菌益生作用的重要因素，是篩選性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定性強(qiáng)的工業(yè)生產(chǎn)菌株的主要指標(biāo)[2]。脂肪酶是一類能夠催化酯的水解反應(yīng)以及在非水相體系中催化脂肪酸和醇類發(fā)生酯化反應(yīng)的酶類。脂肪酶在焙烤食品中可作為綠色生物改良劑；在油脂工業(yè)上可促油脂水解、促酯交換和促酯化；在乳品工業(yè)中可用于乳酯水解，在食品添加劑中應(yīng)用可增香改質(zhì)、提高食品品質(zhì)[3]?？梢?，篩選產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌具有重要的意義。陳超等[4]曾從21A株菌種篩選出一株產(chǎn)蛋白酶活力較高的乳酸乳球菌乳酸亞種并添加到奶牛精飼料中，極顯著地提高了牛乳產(chǎn)量、乳脂率、干物質(zhì)率；黃紫燕等[5]從魚露發(fā)酵液中篩選到一株高產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌T1。但目前我國產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的蛋白酶活性和物種多樣性有待增加，產(chǎn)脂肪酶活性的乳酸菌尚鮮有報道。

我國新疆地區(qū)環(huán)境獨特，少數(shù)名族牧民采用傳統(tǒng)的方法制備酸奶等乳制品，在這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，蘊(yùn)藏著大量的有益乳酸菌，從新疆傳統(tǒng)酸奶中篩選出高產(chǎn)蛋白酶和高產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌，應(yīng)用于發(fā)酵食品中，可以提高原料的酶解能力，產(chǎn)生許多風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)——游離氨基酸和脂肪酸，進(jìn)而改善制品的風(fēng)味，增加產(chǎn)品的功能特性。

本研究分別采用Folin-酚法和銅皂法從新疆傳統(tǒng)酸奶中分離高產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的菌株應(yīng)用與發(fā)酵食品，以開發(fā)和利用保護(hù)我國豐富的乳酸菌資源，為發(fā)酵食品業(yè)行業(yè)提供優(yōu)良的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

1.1.1菌種

菌種：來源于新疆地區(qū)牧民家自制傳統(tǒng)的發(fā)酵酸駝奶、酸牛奶、酸馬奶、酸羊奶中分離得出的40株乳酸菌，其中菌株SM7、H1、H2、H3、H4、A1、A3、RA1、RA2、RA3、RA4、RA5、RB1、RB2、RB3、RB4、RB5、RB6、RC1、RC2、RC3、RC4、RC5來源于新疆酸馬奶[6]：S1、S2、S3來源于新疆酸羊奶；C1、C4來源于新疆酸駱駝奶；B1、B3、B5、B6新疆酸牛奶；SC1、SC2來源于市售泡菜；F1來源于南京衛(wèi)崗牛奶廠新鮮牛糞；L2、L3、L5來源未知；1003、Q12來源于市售酸奶，均保存于寧波大學(xué)海洋學(xué)院實驗室中。

1.1.2培養(yǎng)基

產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩培養(yǎng)基為酪蛋白液體培養(yǎng)基：酪蛋白10 g、牛肉膏2 g、Na2HPO42 g、NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL。酪蛋白固體培養(yǎng)基在酪蛋白液體培養(yǎng)基相同配制上加瓊脂15 g。產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的初篩培養(yǎng)基：每升含0.5 g (NH4)2SO4、0.1 g NH4NO3、0.1 g NaCl、0.1 g MgSO4·7H2O、0.5 g K2HPO4、0.1 g FeSO4·7H2O、25 g瓊脂，121℃滅菌20 min后，冷卻至60℃左右加入含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄欖油乳化液12 mL。用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH 8.0；復(fù)篩培養(yǎng)基為不加瓊脂的初篩培養(yǎng)基。

1.1.3試劑

MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基 上海源葉生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 日本TaKaRa公司；溴甲酚紫、甲苯、油酸、吡啶、橄欖油、考馬斯亮藍(lán)G-250、Tris、醋酸、瓊脂糖、Folin-酚試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

TGL-16高速離心機(jī) 江蘇精達(dá)儀器制造有限公司；LDZX-50FAS立式壓力蒸汽滅菌器、DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SP-722可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計杭州普川科技有限公司；GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；TY10BG-verMINI電泳儀、Mini-PROTEAN 2-D電泳槽、Ecycler plus PCR儀美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選

采用平板劃線法將40株乳酸菌活化3代后，分離在固體酪蛋白培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，觀察有無透明圈以及透明圈的大小，篩選出10株產(chǎn)生透明圈較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[7]。

將初篩得到的10株菌，在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)（37℃），將培養(yǎng)液6 000 r/min離心取上清離心后的上清液用pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液稀釋50倍。利用Folin-酚法[8]測定篩選出的乳酸菌的蛋白酶活力取1 mL稀釋液于試管，置于40℃條件下水浴2 min，再加經(jīng)相同預(yù)熱條件處理的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min后加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，繼續(xù)保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后過濾。另取試管加入濾液1 mL，0.4 mol/L的碳酸鈉5 mL，已稀釋Folin-酚試劑1 mL，搖勻，保溫發(fā)色20 min；空白實驗測定方法同上，只是在加酪蛋白前加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加酪蛋白，在660 nm波長處測吸光度（A600nm）。酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為0、20、40、60、80、100 ?g/mg，方法同上所述酶活力的測定，用吸光度與酪蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作圖，即為蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力定義：在最適條件（25℃）下，每分鐘內(nèi)催化1 ?mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為一個活力單位（U）。

式中：K為吸光常數(shù)；V為反應(yīng)試劑的總體積/mL；t為酶解反應(yīng)時間/min；n為酶液稀釋總倍數(shù)。

1.3.2產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的篩選

利用平板劃線法將40株乳酸菌活化3代后，分離到產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的初篩培養(yǎng)基上，在凝膠成像系統(tǒng)的紫外光下篩選出10株熒光圈較大的菌株用于復(fù)篩[9]。

無菌條件下將初篩得到的菌株接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液6 000 r/min離心，上清液即為粗酶液。利用銅皂法[10]測定粗酶液酶活力。取3 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）和1 mL橄欖油混合預(yù)熱5 min，加1 mL發(fā)酵液，于35℃、200 r/min水浴搖床中反應(yīng)10 min，立即加入8 mL苯，萃取、靜置分層后，將溶液轉(zhuǎn)至離心管中，于4 000 r/min離心10 min。取上層有機(jī)相4 mL，加1 mL顯色劑，充分混合，靜置，離心，取上清液，以相同方法制備不含脂肪酶的空白溶液為對照，于710 nm波長處測吸光度。根據(jù)脂肪酸吸光度工作曲線，計算各菌株脂肪酶活性，獲得產(chǎn)酶能力較高的菌株并保存。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別用0、1、2、3、4、的油酸溶液，方法同上所述酶活力的測定，用吸光度與油酸的濃度作圖，即為脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。脂肪酶活力的計算見下式。

式中：X為脂肪酶活力/（U/mL）；c為脂肪酶濃度/（?mol/mL）；V為脂肪酸溶液的體積/mL；V’為酶液的用量/mL；t為作用時間/min。

1.3.3高效產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶乳酸菌的鑒定

1.3.3.1 16S rRNA序列比對鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取所篩選出的高效產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)脂肪酶乳酸菌菌株的基因組DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。

16S rRNA基因序列：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增正向引物為K1：5’-AACT GAAGAGTTTGATCCTG-GCTC-3’；反向引物為K2：5’-TACGGTTACCTTGT-TACGACTT-3’。PCR反應(yīng)體系：dNTP 4 ?L，引物各1 ?L，MgCl24 ?L，Taq酶0.5 ?L，模板DNA 2 ?L，用ddH2O補(bǔ)至50 ?L。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序。將測序結(jié)果在NCBI BLAST上進(jìn)行DNA序列比對，根據(jù)相似性鑒定菌種[11]。

1.3.3.2生理生化鑒定

乳酸菌生理生化鑒定：對革蘭氏陽性、接觸酶陰性的菌株做硝酸鹽還原實驗、H2S產(chǎn)生實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗，結(jié)果均為陰性的桿菌被鑒定為乳桿菌屬。將分離到的乳桿菌做糖發(fā)酵實驗（葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、半乳糖、纖維二糖、海藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、水楊苷、甘露醇、棉子糖、七葉苷、苦杏仁苷、松三糖）。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選結(jié)果

從40株菌中篩選得到透明圈直徑較大的10株菌為：A5、S2、1003、RC1、RA3、H3、SM7、B2、C4、RA6。10株乳酸菌的蛋白酶活力見圖1。根據(jù)所得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝0.005 5x+0.345 8（R2＝0.988 1），得出RA3的蛋白酶活力最高，達(dá)38.87 U/mL；其次為RC4，為33.58 U/mL；最低的菌株是H3，其蛋白酶活力為3.86 U/mL。菌株RA3平板在可見光照射下的透明圈見圖2。

圖1 篩選出的10 株乳酸菌的蛋白酶活力Fig.1 Protease activities of 10 strains of lactic acid bacteria

圖2 菌株RA3在可見光下的透明圈Fig.2 Transparent circles of strain RA3under visible light irradiation

2.2 產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的篩選結(jié)果

從40株菌中篩選得到10種熒光圈較大的菌株H1、H2、RC1、RC2、RA3、RA4、RC4、RB2、B6、1003進(jìn)行復(fù)篩。10株乳酸菌酶活力見圖3，根據(jù)銅皂法得到脂肪酸的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝0.397 2x+0.143 8（R2＝0.999 3），測得RC4為脂肪酶活力略高于其他菌種，為8.54 U/mL，篩選出的10株乳酸菌脂肪酶活力均高于4.00 U/mL，其中脂肪酶活力最低的菌株H1，為4.03 U/mL。圖4為菌株RC4在紫外光照射下產(chǎn)生的熒光圈。

圖3 篩選出的10 株乳酸菌的脂肪酶活力Fig.3 Lipase activities of 10 strains of lactic acid bacteria

圖4 RC 4 RC4在紫外光下的熒光圈Fig.4 Fluorescent rings of strain RC4under UV light irradiation

2.3菌種鑒定

2.3.1菌株RA3和RC4的16S rRNA序列比對鑒定結(jié)果

在NCBI BLAST中進(jìn)行16S rRNA同源序列比對，結(jié)果得出RA3的16S rRNA序列與發(fā)酵乳桿菌JCM7776（GenBank登錄號為AB911502.1）、M10-5（GenBank登錄號為KF030760.1）等菌株相似度為100%，證明RA3發(fā)酵乳桿菌；RC4與植物乳桿菌NM178-5（GenBank登錄號為HM218736.1）、NM177-2（GenBank登錄號為HM218727.1）等植物乳桿菌相似度為99%，表明RC4為植物乳桿菌。

2.3.2菌株RA3和RC4的生理生化鑒定結(jié)果

菌株RA3的生理生化實驗結(jié)果為（+表示陽性，-表示陰性）：葡萄糖（+）、麥芽糖（+）、乳糖（+）、蔗糖（+）、果糖（+）、半乳糖（+）、纖維二糖（+）、海藻糖（+）、木糖（+）、阿拉伯糖（+）、鼠李糖（+）、水楊苷（+）、蜜二糖（+）、甘露醇（-）、山梨醇（+）、棉子糖（+）、七葉苷（-）、苦杏仁苷（-）、松三糖（-）、革蘭氏（+）、鏡鑒（桿狀）、接觸酶實驗（-）、吲哚實驗（-）、硝酸鹽還原實驗（-）、明膠液化實驗（-）、H2S產(chǎn)生實驗（-）、15℃生長（-）、45℃生長（+）。根據(jù)《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[12]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[13]，鑒定RA3為發(fā)酵乳桿菌，與16S rRNA序列比對結(jié)果一致。

菌株RC4的生理生化實驗結(jié)果為（+表示陽性，-表示陰性）：葡萄糖（+）、麥芽糖（+）、乳糖（+）、蔗糖（+）、果糖（+）、半乳糖（+）、纖維二糖（+）、海藻糖（+）、木糖（+）、阿拉伯糖（+）、鼠李糖（+）、水楊苷（+）、蜜二糖（+）、甘露醇（+）、山梨醇（+）、棉子糖（+）、七葉苷（+）、苦杏仁苷（+）、松三糖（+）、革蘭氏（+）、鏡鑒（桿狀）、接觸酶實驗（-）、吲哚實驗（-）、硝酸鹽還原實驗（-）、明膠液化實驗（-）、H2S產(chǎn)生實驗（-）、15℃生長（+）、45℃生長（+）。根據(jù)《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[12]、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[13]，鑒定RC4為植物乳桿菌，與16S rRNA序列比對結(jié)果一致。

3 討 論

本實驗從新疆地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵酸奶中篩選出高產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌。其中，高產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵乳桿菌RA3的蛋白酶活性為38.87 U/mL，高于方芳等[14]報道的耐熱蛋白酶乳酸菌酶活力（13.13 U/mL）及陳超[4]篩選出來的乳酸菌蛋白酶活力（28.82 U/mL），表明本實驗篩選出來的乳酸菌產(chǎn)蛋白酶的能力較高。篩選出高效產(chǎn)脂肪酶的植物乳桿菌RC4，其酶活力為8.54 U/mL，雖低于穆文俠等[15]在海洋青霉中測得的脂肪酶活力為17.43 U/mL，韓寒冰等[16]在生物柴油脂肪酶產(chǎn)生菌中測得的脂肪酶活力為19.30 U/mL，但目前已報道的脂肪酶產(chǎn)生菌為霉菌等真菌及其他細(xì)菌。

微生物蛋白酶在食品工業(yè)中的用途越來越廣泛。用微生物蛋白酶代替價格較貴的木瓜蛋白酶，可以使肉產(chǎn)生較好的嫰化效果；運(yùn)用于啤酒制造以節(jié)約麥芽用量；在醬油的釀制中添加微生物蛋白酶，能提高產(chǎn)量和質(zhì)量；應(yīng)用于制造水解蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏等。細(xì)菌性蛋白酶還常用于日化工業(yè)，添加到洗衣劑中，以增強(qiáng)去污效果。蛋白酶也可用于環(huán)境治理，它可以降低氮排放量，緩解富營養(yǎng)化以及酸化等環(huán)保難題，還可以降低氨排放，提高飼料轉(zhuǎn)化率，改善空氣質(zhì)量等好處[17-19]。微生物脂肪酶也廣泛應(yīng)用于乳制品的增香、魚片脫脂、食用油加工、洗滌劑添加酶、皮革毛皮絹紡脫脂、制藥、化工合成、污水處理、工具酶等多種用途[20-21]。乳酸菌是一種益生菌，加入食品中能豐富食品的口味和營養(yǎng)價值。目前國內(nèi)以乳酸菌飲料為代表的乳酸菌應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開始成為投資熱點，高產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶的乳酸菌有廣闊的應(yīng)用前景。

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Screening of Lactic Acid Bacteria with High Protease and Lipase Activities from Xinjiang Traditional Yogurt

HE Jie1, ZENG Xiaoqun1,*,LüMingchun1, MAO Zhongxuan1, WANG Xianglin2, PAN Daodong1
(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Faculty of Electrical Engineering and Computer Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

This study aimed to screen lactic acid bacteria with high protease and lipase activities from the traditional yogurt in Xinjiang Province, China. Lactic acid bacterial strain RA3with protease activity of 38.87 U/mL was screened by transparent circle method, and a lipase producing-lactic acid bacterial strain RC4with lipase activity of 8.54 U/mL was screened by copper soap method. The strains RA3and RC4were identified asLactobacillus fermentumandLactobacillus plantarum, respectively, using API 50 CHL physiological and biochemical kit and 16S rRNA sequence alignment. Both strains can provide new starter cultures for fermented foods.

lactic acid bacteria; screening; protease activity; lipase activity

TS252.42

1002-6630（2015）17-0130-04

10.7506/spkx1002-6630-201517025

2014-12-03

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（41406165）；國家星火計劃項目（2013GA701018；2014GA701048）；

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃項目（2014R405045）

何捷（1994—），男，本科生，研究方向為農(nóng)畜產(chǎn)品加工。E-mail：hjx9527@163.com

*通信作者：曾小群（1982—），女，講師，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：zxqun3447@126.com