崔晉龍，郭婷婷,2，王俊宏，王夢(mèng)亮,*

（1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

一株柴胡紅景天中內(nèi)生真菌的抗氧化活性

崔晉龍1，郭婷婷1,2，王俊宏1，王夢(mèng)亮1,*

（1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

對(duì)柴胡紅景天中一株具有抗氧化活性的內(nèi)生真菌Rb-R-1進(jìn)行研究，獲得其分類地位并評(píng)價(jià)抗氧化活性強(qiáng)弱。結(jié)果表明：這株真菌為Ascomacota門Hypocreales目Neonectria屬的N. ramulariae真菌，具有較強(qiáng)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、NO2-清除能力和Fe2+螯合能力，IC50值分別為8.86、4.40、9.65、16.53、1.91 mg/mL；其發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總黃酮含量分別達(dá)18.12、22.48 mg/g。發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果表明，在以乳糖為碳源、牛肉膏為氮源、裝液量90 mL/250 mL、pH 7.0、25℃條件下培養(yǎng)10 d時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率最大，達(dá)到93.12%；總酚和總黃酮含量最高，分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g。

柴胡紅景天；內(nèi)生真菌；抗氧化；發(fā)酵條件優(yōu)化

高山植物紅景天（Rhodiola roseaL.）是2002年我國衛(wèi)生部頒布的“關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51）”中規(guī)定的“可用于保健食品的物品”之一，也是世界許多民族長期使用的抗氧化植物藥和食品添加原料[1]。在我國，紅景天主要分布于海拔超過3 000 m的高寒、強(qiáng)紫外線輻射、多風(fēng)的青藏高原等山區(qū)[2]，其主要化學(xué)成分有40多種，包括苯丙烷類、苯乙醇及它們的衍生物[2-3]如紅景天苷、酪醇等[3]，許多屬于酚類、黃酮類物質(zhì)的范疇，這賦予了紅景天良好的以抗氧化和抗缺氧雙向調(diào)節(jié)為基礎(chǔ)的抗高山反應(yīng)、抗衰老、抗疲勞等適應(yīng)原活性[4]。

內(nèi)生真菌，是生活于健康植物組織內(nèi)部，不引起植物明顯病原特征的微生物[5]。在長期的共進(jìn)化過程中，內(nèi)生真菌與宿主共同應(yīng)對(duì)各種生物與非生物脅迫，形成了專一性很強(qiáng)的共生關(guān)系[5-6]。自1993年Stierle等[6]從紅豆杉內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae中分離出紫杉醇以來，人們陸續(xù)從特定功能的藥用植物中分離出了類似功能的多種內(nèi)生真菌[7]。因此，從特定藥理功能植物中尋找特定活性的內(nèi)生真菌已成為尋找新天然產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)[8]。

截至目前，大多數(shù)這樣的內(nèi)生真菌來自于溫帶或亞熱帶植物[9]，而對(duì)高山、海洋等特殊環(huán)境中的植物，尤其是具有特定功能的珍稀植物研究很少[10]。尤其是對(duì)于紅景天內(nèi)生真菌的研究，國內(nèi)外均無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)我國主要的紅景天品種——柴胡紅景天（Rhodiola bupleuroides）內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究，獲得一株具有開發(fā)價(jià)值的抗氧化活性內(nèi)生真菌，在明確其分類地位的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為這一資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

柴胡紅景天于2012年9月采集于西藏米拉山口（海拔5 700 m，東經(jīng)92 °22’50”，北緯29 °11’25”），由山西大學(xué)崔晉龍副教授鑒定為柴胡紅景天（R. bupleuroides）[11]。真菌Rb-R-1分離自柴胡紅景天的健康塊莖。以上材料與菌種均保藏于山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所。

1.2儀器與設(shè)備

PTX200聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；BX53攝影生物顯微鏡 日本Olympus公司；HEI-VAP/LR20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Heidolph公司；CS/50CXII型高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1真菌Rb-R-1的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將真菌Rb-R-1接種于察氏（Czapek’s，CZ）培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征；挑取菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲、孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征，鑒定真菌Rb-R-1的屬種。

分子鑒定：采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取真菌R b-R-1的基因組D N A，用引物I T S 1（T C C G T A G G T G A A C C T G C G G）和I T S 4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[12]對(duì)真菌rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保藏。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將序列提交至GenBank（http∶//www.ncbi. nlm.nih.gov/），進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA 4.0軟件進(jìn)行相似菌種的Neighbor-Joining（NJ）遺傳樹構(gòu)建，確定其遺傳關(guān)系，最終確定其屬種地位。

1.3.2內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中總酚、總黃酮含量的測定

將純化好的內(nèi)生真菌Rb-R-1接種于裝有100 mL液體CZ培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL）中，25℃、120 r/min培養(yǎng)10 d，4層紗布過濾。收集濾液，10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入5倍體積的95%乙醇，去除沉淀。上清液于45℃、8×103Pa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，獲得發(fā)酵液濃縮物，稱質(zhì)量。加無菌去離子水定容為10 mg/mL的樣液，置于4℃條件下備用。

總酚含量的測定采用Fo lin-酚法[13]：配制0.05、0.10、0.15、0.25、0.50 mg/mL的沒食子酸對(duì)照品梯度溶液，分別移取1 mL于100 mL容量瓶中，加入60 mL水、5 mL Folin-酚試劑混勻；在0.5～8 min內(nèi)，加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%Na2CO3溶液，搖勻，去離子水定容；20℃放置2 h，于765 nm波長處測定吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝1.396 96x-0.001 28（R2＝0.999 9）。

總黃酮含量的測定采用蘆丁法[14]：分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液（0.20 mg/mL）至10 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min；最后加入10%NaOH溶液4.0 mL，去離子水定容后搖勻；放置15 min，在510 nm波長處測定其吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝8.238 19x-0.009 5（R2＝0.999 3）。

以1 mL樣液分別代替沒食子酸和蘆丁，通過上述方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出真菌發(fā)酵液粗提物中的總酚、總黃酮含量。

1.3.3內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化能力測定

內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力，亞鐵離子（Fe2+）螯合能力測定及計(jì)算參照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行；亞硝酸根離子（NO2-）清除能力測定及計(jì)算參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行。

采用南京建成生物工程研究所研制的總抗氧化能力測定試劑盒對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的總抗氧化能力進(jìn)行測定?？偪寡趸芰Γ║）定義為在37℃時(shí)，每分鐘每毫升待測液使反應(yīng)體系的光密度（OD520nm）值每增加0.01為一個(gè)總抗氧化能力單位。根據(jù)下式計(jì)算內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的總抗氧化能力。

式中：OD0為空白對(duì)照組的光密度；ODi為樣品組或陽性對(duì)照組反應(yīng)體系的光密度；發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量＝待測液體積/mL×待測液質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。O2-·清除能力測定實(shí)驗(yàn)中以乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic aciddisodium salt，EDTA-2Na）為陽性對(duì)照，其余實(shí)驗(yàn)均以VC為陽性對(duì)照。各抗氧化實(shí)驗(yàn)中內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力以IC50值表示，其值越小，表明發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.4內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.4.1單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以CZ培養(yǎng)基為菌種發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別測定不同碳源、氮源、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響。

分別選擇可溶性淀粉（C-A）、乳糖（C-B）、蔗糖（C-C）、葡萄糖（C-D）、麥芽糖（C-E）為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的碳源，添加量均為30 g/L；固定氮源為硝酸鈉、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以酵母膏（N-A）、蛋白胨（N-B）、牛肉膏（N-C）、硝酸鈉（N-D）、氯化銨（N-E）為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的氮源，添加量均為3 g/L；固定碳源為乳糖、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的初始pH值；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、發(fā)酵溫度為30℃、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以15、20、25、30、35、38℃為內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵的發(fā)酵溫度；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、裝液量為120 mL、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以30、60、90、120、150、180 mL為內(nèi)生真菌Rb-R-1在250 mL三角瓶中發(fā)酵的裝液量；固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25℃、發(fā)酵時(shí)間為8 d，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

分別以4、6、8、10、12、14 d為內(nèi)生真菌Rb-R-1的發(fā)酵時(shí)間，固定碳源為乳糖、氮源為牛肉膏、pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25℃、裝液量為90 mL，測定發(fā)酵完成后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率。

1.3.4.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以獲得最佳發(fā)酵條件。選取碳源量、氮源量、初始pH值、發(fā)酵溫度、裝液量5個(gè)因素，每個(gè)因素選取4個(gè)水平，利用DPS軟件設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件。在正交試驗(yàn)獲得的最佳發(fā)酵條件下，進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵時(shí)間（分別培養(yǎng)4、6、8、10、12 d）。同時(shí)測定優(yōu)化條件下發(fā)酵液中的總酚、總黃酮含量，以最終確定內(nèi)生真菌Rb-R-1的最佳發(fā)酵條件。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

抗氧化實(shí)驗(yàn)中內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0分析完成。數(shù)據(jù)的差異顯著性采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件，通過最小顯著差異法（least-significant difference，LSD）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌Rb-R-1鑒定結(jié)果

內(nèi)生真菌Rb-R-1的菌落為黃褐色，表面菌絲黃白色，短絨狀，背面深橘黃色；分生孢子無色，圓柱狀，連續(xù)產(chǎn)生；分生孢子梗直，細(xì)長，無色，分支不規(guī)則。結(jié)合文獻(xiàn)[17]的報(bào)道，鑒定此菌為柱孢屬真菌（Cylindrocarponsp.），其菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)如圖1所示。對(duì)該菌進(jìn)行rDNA-ITS測序，將測序結(jié)果提交至GenBank，獲得序列登錄號(hào)為KJ542260，與GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果表明，該菌與Neonectria ramulariae（GenBank登錄號(hào)KM249079）具有100%的同源性和99%的相似性；另外，將該菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中同源性高度相似的菌種進(jìn)行NJ遺傳樹的構(gòu)建，進(jìn)一步確定了其遺傳關(guān)系（圖2）；結(jié)合前人研究成果[18]，最終確定N. ramulariae為C. obtusiusculum的有性型。因此，鑒定內(nèi)生真菌Rb-R-1為N. ramulariae或C. obtusiusculum真菌。

圖1 內(nèi)生真菌Rb-R-1的菌落（A）及顯微（B）形態(tài)特征Fig.1 Colony (A) and morphological (B) characteristics of Rb-R-1

圖2 基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的Rb-R-1與其相似序列菌株的NJ遺傳樹Fig.2 Neighbor-Joining tree of Rb-R-1 and its similar isolates based on their rDNA-ITS sequences

2.2內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性及總酚與總黃酮含量

通過6種抗氧化活性測定方法對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1的抗氧化能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，由表1可知，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度與抗氧化能力成量-效關(guān)系。隨著發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增大，其抗氧化能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率、·OH清除率、O2-·清除率、NO2-清除率、Fe2+螯合率、總抗氧化能力均達(dá)到最大值，分別為62.65%、79.99%、51.44%、28.00%、85.80%和4.72 U/mL。從IC50值可以看出，與陽性對(duì)照VC和EDTA-2Na相比，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的DPPH自由基、·OH、O2-·清除能力和Fe2+螯合能力較好。內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總黃酮的含量分別為18.12、22.48 mg/g；總抗氧化能力測定結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物和VC的總抗氧化能力分別為4.72 U/mL和28.78 U/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化能力Table1 Antioxidant activities of the fermentation supernatant of Rb-R-1 at different concentrations

2.3內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，不同單因素培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力不同。

圖3 不同碳源對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖3所示，不同碳源培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為乳糖（43.21%）＞蔗糖（37.69%）＞葡萄糖（36.40%）＞麥芽糖（35.91%）＞可溶性淀粉（32.53%）。

圖4 不同氮源對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

如圖4所示，不同氮源培養(yǎng)條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為牛肉膏（56.40%）＞蛋白胨（54.36%）＞酵母膏（48.70%）＞硝酸鈉（45.14%）＞氯化銨（43.28%）。

以乳糖和牛肉膏分別為碳源和氮源時(shí)，各單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖5～8）表明，當(dāng)初始pH值為7.0、發(fā)酵溫度為25 ℃、裝液量為90 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物具有最高的DPPH自由基清除率，分別為64.65%、68.61%、70.08%和78.71%。

圖5 不同初始pH值對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of different pH values on the DPPH radical scavengingcapacity of Rb-R-1 fermentation products

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖7 不同裝液量對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.7 Effects of different medium volumes on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of different fermentation times on the DPPH radical scavenging-capacity of Rb-R-1 fermentation products

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 內(nèi)生真菌Rb-R-1最佳發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimal culture conditions of Rb-R-1

各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。極差R值的大小表示該因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的大小，如表2所示，各因素對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力影響大小為：氮源量＞發(fā)酵溫度＞碳源量＞裝液量＞初始pH值。k值為不同發(fā)酵條件下同一因素相同水平下的DPPH自由基清除率平均值。取k值最大時(shí)對(duì)應(yīng)的因素水平，即可得出最優(yōu)組合為A1B1C3D2E2，即最佳發(fā)酵條件為碳源量（乳糖）20 g/L、氮源量（牛肉膏）1 g/L、初始pH 7.0、發(fā)酵溫度25℃、裝液量90 mL/250 mL。

進(jìn)一步對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。因素A、B、C、D、E差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明這5個(gè)因素對(duì)內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的影響都較大。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array dessiiggnn

以上述最佳發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，再次進(jìn)行最佳發(fā)酵時(shí)間測定的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)10 d后，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大，為93.12%，明顯高于正交試驗(yàn)優(yōu)化前的單因素試驗(yàn)結(jié)果。在上述最優(yōu)發(fā)酵條件下，內(nèi)生真菌Rb-R-1發(fā)酵產(chǎn)物中的總酚、總黃酮含量分別為19.14 mg/g和28.25 mg/g，均高于優(yōu)化前的含量，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果良好。

3 討 論

新叢赤殼屬（Neonectriasp.）真菌是叢赤殼科（Nectriaceae）的重要成員，物種較多。1999年，分類學(xué)家重新澄清了其屬的概念，認(rèn)為它們的無性型均屬于柱孢屬（Cylindrocarpon）[19-20]。該真菌地理范圍分布很廣，遍布亞洲、歐洲、北美洲[21]。同時(shí)，Zhao Peng等[21]采用DNA條形碼（ITS rDNA、β-tubulin、EF-1α和RPB2）對(duì)該屬真菌的分類地位和遺傳關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)總結(jié)。該真菌與宿主共生方式多樣，曾經(jīng)作為蟲生真菌[22]、云杉小蠹蟲伴生真菌[21]、內(nèi)生真菌[21,23]、植物病原菌[18]被廣泛分離和研究。而在本實(shí)驗(yàn)中，此真菌作為內(nèi)生真菌從柴胡紅景天中被分離出來，這為高山植物紅景天微生態(tài)群落的探討提供了依據(jù)。

該真菌作為植物內(nèi)生真菌或菌根真菌從多種植物中分離出來，表現(xiàn)出了多種多樣的生物活性，是尋找天然產(chǎn)物的良好真菌資源。日本學(xué)者Shiono等[23]從糙米中分離了內(nèi)生真菌N. ramulariae，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的兩種新堿Pyrrospirones A和B具有抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能；另一項(xiàng)研究表明，N. ramulariae具有產(chǎn)生可以降解聚氨酯等塑料物質(zhì)的酶的能力[24]。而在本實(shí)驗(yàn)中，N. ramulariae被從以強(qiáng)抗氧化能力著稱的柴胡紅景天中分離出來，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化能力，這顯示出內(nèi)生真菌與宿主在功能上的一致性，這為進(jìn)一步豐富該真菌的功能多樣性提供了證據(jù)，也為從柴胡紅景天內(nèi)生真菌中尋找新的天然抗氧化劑提供了可能。

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An Endophytic Fungus with Antioxidant Activity from Rhodiola bupleuroides

CUI Jinlong1, GUO Tingting1,2, WANG Junhong1, WANG Mengliang1,*
(1. Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this study, we reported for the first time an endophytic fungus, named Rb-R-1, with antioxidant activity isolated and identified fromRhodiola bupleuroides. The isolate Rb-R-1 was affiliated toNeonectria ramulariaebelonging to the order Hypocrealesin the phylumAscomacota. The fungus possessed high scavenging activities against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),·OH, O2-·and NO2-radicals and Fe2+chelating activity, with half maximal inhibitory concentration (IC50) of 8.86, 4.40, 9.65, 16.53 and 1.91 mg/mL, respectively. The contents of total phenolics and total flavonoids in the concentrated culture supernatant of Rb-R-1 were 18.12 and 22.48 mg/g, respectively. The optimal culture conditions that provided maximal DPPH radical scavenging rate (93.12%) were determined as lactose as the carbon source, beef extract as the nitrogen source, initial pH 7.0, 90 mL of the medium in a 250-mL flask and 25℃. In the meantime, the maximal contents of total phenolics and total flavonoids of 19.14 and 28.25 mg/g, respectively, were obtained under these culture conditions.

Rhodiola bupleuroides; endophytic fungi; antioxidant; fermentation condition optimization

Q939.5

1002-6630（2015）17-0022-06

10.7506/spkx1002-6630-201517005

2014-11-03

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270383）；2012年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20121401120001）；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014011029-1）

崔晉龍（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檎湎∷幱弥参锛八幱谜婢Y源開發(fā)。E-mail：cjl717@163.com

*通信作者：王夢(mèng)亮（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幬镏虚g體合成及開發(fā)。E-mail：mlwang@sxu.edu.cn