玥 ，平泉瑞，劉俐君，劉寧政，鄧學(xué)兵*

（1.南京日升昌生物技術(shù)有限公司 江蘇南京211103；2.江蘇省獸藥飼料檢驗(yàn)所 江蘇南京210036；3.達(dá)州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心四川達(dá)州635000；4.南京市江寧區(qū)人民政府東山街道辦事處江蘇南京 211100）

枯草芽孢桿菌粉劑生產(chǎn)工藝的研究

馬光友1，宋慧敏2，熊玥2，平泉瑞1，劉俐君3，劉寧政4，鄧學(xué)兵1*

（1.南京日升昌生物技術(shù)有限公司 江蘇南京211103；2.江蘇省獸藥飼料檢驗(yàn)所 江蘇南京210036；3.達(dá)州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心四川達(dá)州635000；4.南京市江寧區(qū)人民政府東山街道辦事處江蘇南京 211100）

芽孢因可以耐受高溫應(yīng)激可以用多種方法將發(fā)酵液制成粉劑，常用方法有噴霧干燥和冷凍干燥[1,2]，但是這常規(guī)先進(jìn)方法設(shè)備投入較大。我們利用現(xiàn)有設(shè)備生產(chǎn)高質(zhì)量的菌粉?；旧a(chǎn)流程為將發(fā)酵液離心，獲得菌泥，菌泥與載體混合后烘干，最后粉碎制成成品。為了提高回收率，我們對每一步生產(chǎn)中的參數(shù)進(jìn)行了設(shè)定并實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們得出了最佳的生產(chǎn)工藝，具體參數(shù)為發(fā)酵液進(jìn)入離心機(jī)的流量為400 L/h，排渣時(shí)間為6 min，載體與菌泥的混合比例為2∶1，烘干時(shí)干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度為70℃，烘3 h。

枯草芽孢桿菌；微生態(tài)制劑；粉劑；載體；回收率

由于抗生素的大量使用，隨之出現(xiàn)的負(fù)面效應(yīng)也日益突出，表現(xiàn)為病原微生物產(chǎn)生耐藥性和藥物在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留，從而對人類的健康產(chǎn)生潛在的危害。因此，抗生素替代品益生菌、酶制劑、酸制劑等的研究與開發(fā)成為近年來綠色飼料添加劑的熱點(diǎn)，其中益生菌備受關(guān)注。芽孢桿菌能夠形成耐熱、耐旱、抗紫外線的芽孢，是研制生防菌劑極好的材料[3-5]。在動(dòng)物生產(chǎn)中的作用是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員所關(guān)注的焦點(diǎn)[6,7]?？莶菅挎邨U菌能夠形成芽孢，通過一定的方法制成固體制劑不僅可以減少產(chǎn)品體積，便于運(yùn)輸，更能夠擴(kuò)大產(chǎn)品的使用范圍，給生產(chǎn)生活帶來便利。通過不斷的探索實(shí)驗(yàn)，我們已經(jīng)將發(fā)酵液中芽孢的形成率控制在99%以上，發(fā)酵液中菌數(shù)控制在180億cfu/mL以上，但是怎樣能夠最大限度的將菌液分離，使芽孢最大限度的轉(zhuǎn)移到固體中，我們進(jìn)行了一系列的研究。

1 材料及方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌來自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC 20872）。

1.2 實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵設(shè)備

發(fā)酵罐（浙江雙子機(jī)械制造有限公司）；DHC310蝶片式自動(dòng)排渣分離機(jī)（遼陽陽光制藥機(jī)械有限公司）；槽型混合機(jī)（廣州市海締機(jī)械科技有限公司）；FG-200高效沸騰干燥機(jī)（常州恒城富士特干燥設(shè)備有限公司）；WF萬能粉碎機(jī)（南京神鵬機(jī)械設(shè)備有限公司）；YJ-875潔凈工作臺（吳江市佳運(yùn)通空調(diào)凈化設(shè)備有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

生產(chǎn)基本流程：枯草芽孢桿菌發(fā)酵液→蝶片式自動(dòng)排渣分離機(jī)→菌泥與菌體載體按比例混勻→高效沸騰干燥機(jī)烘干→萬能粉碎機(jī)粉碎。

1．3．1 蝶片式自動(dòng)排渣分離機(jī)的參數(shù)設(shè)定 首先設(shè)定進(jìn)入碟片式分離機(jī)的流速分別為200、400、600、800、1 000 L/h，通過平板計(jì)數(shù)法[8]測定上清液中菌數(shù)確定流速。待流速確定之后設(shè)定排渣時(shí)間分別為4、6、8、10、12 min，利用平板計(jì)數(shù)法測定上清液（廢液）中殘留的菌落數(shù)確定排渣時(shí)間。

1．3．2 菌泥與載體的比例確定 設(shè)定載體與菌泥的混合比例為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1（重量比），烘干后測定回收率。烘干條件為50℃，直至烘干?；厥章实挠?jì)算方式為：首先將離心后的菌泥混合均勻，測定菌泥中單位菌落數(shù)（cfu/g），乘上重量就是菌泥的總菌數(shù)。然后按比例混合均勻，烘干后測定成品單位菌落數(shù)，乘上成品重量就是成品總的菌數(shù)。兩者之比就是回收率。通過測定混合后水分[9]與烘干后活菌的回收率，確定最佳的混合比例，以確保在最短的時(shí)間內(nèi)得到最高的活菌回收率[10]。

1．3．3 高效沸騰干燥機(jī)參數(shù)設(shè)定 熱空氣的進(jìn)風(fēng)溫度直接影響著烘干時(shí)間和活菌回收率。設(shè)定進(jìn)風(fēng)溫度在50、70、90、110℃，通過測定烘干后活菌的回收率，確定最佳的進(jìn)風(fēng)溫度?；罹厥章实挠?jì)算方法同1.3.2，具體公式如下：

活菌回收率計(jì)算公式（%）=

2 結(jié)果

2.1 蝶片式自動(dòng)排渣分離機(jī)參數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同流速對上清液殘留菌數(shù)的影響

從圖1可以看出進(jìn)入離心機(jī)的流量在200 L/h時(shí)，上清液中殘留的菌數(shù)為0.24億cfu/mL，當(dāng)進(jìn)入離心機(jī)的流量在400 L/h時(shí)，上清液中殘留的菌數(shù)為1.09億cfu/mL。雖然400 L/h離心時(shí)廢液中殘留的菌數(shù)很大，但是考慮占發(fā)酵液（發(fā)酵液為180億cfu/mL）中菌數(shù)的比重、離心所需時(shí)間、工人成本以及耗電量等問題，最終確定流量為400 L/h。

圖2 不同排渣時(shí)間對上清液中殘留菌數(shù)的影響

從圖2可以看到，在流速（400 L/h）恒定的前提下發(fā)酵液進(jìn)入離心機(jī)，排渣時(shí)間為4 min時(shí)，廢液中殘留的菌數(shù)為0.09億cfu/mL，當(dāng)排渣時(shí)間為6 min時(shí)，上清液中殘留的菌體為0.89億cfu/mL。雖然排渣時(shí)間為4 min時(shí)，廢液中菌體數(shù)量最少，但是分離出來的菌泥含水量很大，給后續(xù)混合，烘干帶來很大的負(fù)擔(dān)。排渣時(shí)間為6 min時(shí)，廢液中有0.89億cfu/mL的菌體，但是相比發(fā)酵液母液180億cfu/mL的量來講，其比重是很小的?？紤]到烘干時(shí)成本以及混合時(shí)用載體的量等多種因素，確定排渣時(shí)間為6 min。

綜合兩組實(shí)驗(yàn)確定離心機(jī)的參數(shù)為：進(jìn)入離心機(jī)的流量為400 L/h，排渣時(shí)間為6 min。

2.2 菌泥與載體的混合比例實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 不同混合比例對水分和菌體回收率的影響

從圖3可以看出載體與菌泥的混合比例為2∶1，也就是載體的比例為66.7%時(shí)，菌泥與載體混合后水分為60%，活菌回收率最高為67.2%。因此選擇混合比例2∶1作為最佳的混合條件。

按照常規(guī)認(rèn)為，載體比例越大，水分含量越少，烘干所需的時(shí)間就越少，菌體的回收率越大，但是實(shí)際上并不這樣。分析如下：水份太高時(shí)，烘干時(shí)間太長，芽孢經(jīng)歷的烘干時(shí)間長，所以成活率偏低。而水分太小時(shí)，高溫直接接觸芽孢，沒有水分揮發(fā)時(shí)帶來的降溫保護(hù)作用，反而死亡率升高。

2.3 沸騰干燥參數(shù)的確定

圖4 不同進(jìn)風(fēng)溫度對烘干時(shí)間和活菌回收率的影響

從圖4可以看到，熱空氣進(jìn)風(fēng)溫度分別為50℃和70℃時(shí)，烘干時(shí)間分別為4 h和3 h，活菌回收率分別為67%和64%，而到進(jìn)風(fēng)溫度為90℃時(shí)回收率急劇下降，說明這個(gè)時(shí)候的芽孢對溫度還是很敏感。50℃和70℃的回收率差異不大，但是機(jī)器多運(yùn)轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)所消耗的能源很高。綜合能耗，人工等情況選擇70℃烘干3 h作為烘干條件。烘干后產(chǎn)品經(jīng)過粉碎機(jī)粉碎，再經(jīng)過混合機(jī)混合就可以變成成品包裝了。

3 討論

通過本次研究，探索了發(fā)酵液離心，菌泥與載體混合比例，以及烘干溫度控制等方面的內(nèi)容。雖然試驗(yàn)時(shí)有最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，還要考慮生產(chǎn)能力和投入產(chǎn)出比等實(shí)際問題。經(jīng)過比較實(shí)驗(yàn)我們篩選出的生產(chǎn)條件為：發(fā)酵液進(jìn)入離心機(jī)流量為400 L/h，離心機(jī)排渣時(shí)間為6 min，離心出的菌泥與載體混合比例為1∶2，烘干時(shí)沸騰干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度為70℃，烘3 h。按照這個(gè)參數(shù)進(jìn)行生產(chǎn)時(shí)，發(fā)酵液中菌體轉(zhuǎn)移到產(chǎn)品中的比例為68.2%。

通過這個(gè)中試試驗(yàn)我們摸索了規(guī)?；a(chǎn)中的一些經(jīng)驗(yàn)，也意識到了自己的不足。市場需求量巨大。因此下一階段我們的工作就是探索如何能夠進(jìn)一步的擴(kuò)大產(chǎn)能，提高回收率和提高生產(chǎn)效率?！觯ň庉嫞旱一郏?/p>

[1] 陳羽.枯草芽孢桿菌高密度培養(yǎng)及保護(hù)劑的優(yōu)化研究[D].哈爾濱.東北農(nóng)業(yè)大學(xué).2011.

[2] 李寧,田洪濤,吳蕊,等.雙歧桿菌微膠囊噴霧干燥工藝的影響因素研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(8):89-91.

[3] 0bagwu J,Korsten L.Integrated Control of Citrus Green and Blue MoldsusingBacillussubtilisin Combination with Sodium Bicarbonate or Hot Water[J].Postharvest Biology and Technology, 2003,28:187-194.

[4] Spinosa M R,Braccini T,Ricca E,et a1.0n the Fate of Ingested Bacillus Spores[J].Research in Microbiology,2000,151:361-368.

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[6] 秦玉昌,潘寶海,于榮.芽孢桿菌對畜禽生產(chǎn)性能的影響[J].中國飼料,2004,(16):8.

[7] 連常平.芽孢桿菌的生產(chǎn)方法及該菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科技情報(bào),2005,32(3):114-116.

[8] GB/T 26428—2010.飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測[S].

[9] GB/T6435-2006.飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測定[S].

[10] 王劍,王楠,高觀朋,等.200億芽孢/g枯草芽孢桿菌可濕性粉劑

的研制[J].農(nóng)藥,2010,49（7）:486-489.

2.2方法檢出限、定量限和線性范圍

Producing Process Study about how to Produce Powder of Bacillus Subtills

Ma Guangyou1，Song Huimin2，Xiong Yue2，Ping Quanrui1，Liu Lijun3，Liu Ningzheng4，Deng Xuebing1*
(1.Nanjing Risingsun Biotechnology Co.,Ltd,Nanjing Jiangsu,211103; 2.Jiangsu Province Inspection Institute of Veterinary Drug and Feedstuff,Nanjing Jiangsu,210036; 3.Dazhou City Animal Disease Prevention and Control Center,Dazhou Sichuan,635000; 4.Jiangning District People's Government Dongshan Street Agency,Nanjing Jiangsu,211100)

Because bacillus spores can endure stress of high temperature,so spore fermentation can be made into powder through many ways like spray-drying and freeze-drying[1,2].But these normal advanced ways need expensive equipments.Now we use our existing machines to produce high quality powder.0ur production process continues four steps:first fermentation must be centrifugal separated to get bacteria mud,then mud mixed with carrier,the next step is to dry the mixture to get semi-product,finally crush the semi-product to get production.For improving the recovery of spore,we set many parameters on every step to get best production process.After experiments,we get the best production process about our equipments.The specific parameters are: the current speed of fermentation into butterfly separator is 400 L/h,and the discharge time of butterfly separator is 6 min.When mud is mixed with carrier,the proportion is 1 to 2.And the temperature into boiling drier is 70℃,and dry the mixture for 3 hour.

bacillus subtilis；probiotics；powder；carrier；percent recovery

10.3969/j.issn.1008-4754.2015.02.026

*通訊作者：鄧學(xué)兵。