吳 嘉,謝 謙,張寧波,毛吉炎,袁建輝*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東深圳518036;2.深圳市疾病預(yù)防控制中心)

Graves病患者外周血中樹突狀細胞及相關(guān)細胞因子的變化

吳 嘉1,謝 謙1,張寧波1,毛吉炎2,袁建輝2*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東深圳518036;2.深圳市疾病預(yù)防控制中心)

目的 檢測Graves病人外周血細胞因子和樹突狀細胞(DCs)不同亞群的數(shù)量和表達情況,初步探討DCs細胞亞群在疾病中的作用。 方法 利用流式細胞儀檢測30例Graves病患者和30名健康體檢者的外周血樹突狀細胞亞群數(shù)量,同時利用ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)及IL-6等細胞因子的水平。 結(jié)果 測得Graves組髓樣樹突狀細胞(pDC)和漿細胞樣樹突狀細胞(mDC)值均高于正常對照組。ELISA檢測細胞因子發(fā)現(xiàn),Graves患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于正常對照組,其中TNF-α顯著升高(P＜0.01),而IL-2水平顯著低于對照組(P＜0.01)。 結(jié)論 Graves病人中pDC和mDC水平升高,細胞因子分泌失調(diào),Th1/Th2失衡,從而導(dǎo)致機體自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

Graves病; 樹突狀細胞; 細胞因子

格雷夫斯病(Graves'disease,GD)又稱毒性彌漫性甲狀腺腫,是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病(ATID)[1]。樹突狀細胞(DC)是目前已知的體內(nèi)功能最強的專職性抗原提呈細胞,根據(jù)其表面標(biāo)記,可將其分為髓樣樹突狀細胞(mDC)和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC),他們可以激活初始的T淋巴細胞向Th1、Th2細胞分化。本研究采用流式細胞儀技術(shù)檢測Graves病血液中mDC、pDC的變化,并用ELISA檢測TH1、TH2相關(guān)的細胞因子,以探索DC細胞亞群與TH1/TH2細胞失衡的關(guān)系,初步研究DC細胞在Graves疾病發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑

流式細胞儀BD FACSArial,淋巴細胞分離液,熒光抗體,pDC標(biāo)記試劑:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS;mDC標(biāo)記試劑:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;鞘液、溶血素、HUMAN TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA KIT 等。

1.2 一般資料

收集本院2013年5月～2014年2月門診及住院Graves病患者30例(均無其他自身免疫性疾病,1年內(nèi)沒有使用過免疫抑制劑),其中男性14例(46.7%),女性16例(53.3%);平均年齡42.6歲。另選同期30例年齡和性別匹配的健康志愿者作為正常對照組,男女各15例(50%),平均年齡為41.8歲。兩組的平均年齡、性別的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。研究經(jīng)醫(yī)院批準(zhǔn)并在開始前均獲得研究對象的知情同意。

1.3 外周血單個核細胞(PBMC)的分離

取研究對象的抗凝靜脈血5 mL,1 000 r/min離心10 min,留取血清后再用等體積的PBS液稀釋1倍,加入淋巴細胞分離液,密度梯度離心,3 000 r/min離心20 min,收集單核細胞層于15 mL離心管中,用PBS液洗滌2次,得到PBMC,用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.4 DC比例檢測

取200μL PBMC細胞懸液分別加入熒光抗體(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;另取200μL PBMC細胞懸液加入FITC-mouse IgG和PE-mouse IgG混勻后室溫避光放置30 min;每管加入2 mL PBS混勻后洗滌3次,再加入1 mL PBS重懸,流式細胞儀檢測pDC和mDC占淋巴細胞的比例。

1.5 細胞因子檢測

分離Graves組和正常對照組血清,利用ELISA檢測試劑盒分別檢測 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 細胞因子水平,具體實驗步驟按ELISA檢測試劑盒說明書進行。最后利用酶標(biāo)儀檢測492 nm處吸光度(OD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品中各個細胞因子的濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One Way ANOVA)。進一步進行組間兩兩比較時,采用SNK檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血pDC和mDC水平的比較

利用流式細胞儀檢測Graves組和正常對照組外周血單核細胞中pDC及mDC亞群水平變化,結(jié)果見表1。與正常對照組相比,Graves組pDC和mDC水平均顯著性升高(P＜0.01)。

表1 Graves組與正常對照組DC亞群在外周血單核細胞的比例_____________________________________________

2.2 血清細胞因子水平檢測

酶聯(lián)免疫檢測Graves組和正常對照組細胞因子的濃度,結(jié)果見表2。檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Graves組血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-6細胞因子均高于正常對照組,其中TNF-α顯著升高了2.7倍(P＜0.01),而IL-2顯著低于正常對照組(P＜0.01)。

表2 Grave組與正常對照組血清中細胞因子濃度的比較(pg/mL)

3 討 論

Graves病是一種伴甲狀腺激素分泌增多的器官特異性自身免疫病,其發(fā)病機理十分復(fù)雜,細胞免疫和體液免疫紊亂均與GD免疫病理形成密切相關(guān)。目前研究表明:多種免疫細胞、細胞因子和miRNA共同參與了GD發(fā)病機制,尤其是T淋巴細胞、DC細胞及其相關(guān)因子[2-3]。

樹突細胞是人體內(nèi)最強的抗原提呈細胞,根據(jù)細胞表型常分為mDC和pDC兩亞群,mDC為CD14+、CD16+、CD33+、D85K+,主要發(fā)揮抗原提呈的功能,促進細胞免疫的發(fā)生,mDC是人體主要的抗原提呈細胞(APC),激活體內(nèi)T淋巴細胞,同時參與初始(native)T細胞的活化,在特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用;pDC為CD14+、CD16+、CD123+、D85K+,主要產(chǎn)生干擾素TFN-α,促進體液免疫的發(fā)生[4]。pDC除有較弱的APC功能外,在人體受到病毒攻擊時pDC還可以產(chǎn)生大量干擾素,抑制病毒復(fù)制和增強人體免疫功能,從而在天然的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[5]。本實驗通過流式細胞儀分別檢測(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5,得到病患者血液中pDC和mDC在淋巴細胞中的比例,結(jié)果表明兩者均高于正常對照組,說明Graves病即與體液免疫有關(guān),又受到細胞免疫的影響。目前關(guān)于許多研究都表明DC細胞與多種病病的發(fā)生有關(guān)[5-6],如:紅斑狼瘡、哮喘等等。

此外本研究通過ELISA檢測Grave病患者血清細胞因子,發(fā)現(xiàn) TNF-α、IFN-γ、IL-6 顯著升高,而 IL-2顯著降低(P＜0.01)。這些細胞因子主要是輔助T細胞產(chǎn)生具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或肽類,他們通過與各目的靶細胞表面特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用[7]。Th1細胞激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng),介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答,主要分泌 IL-2和 IFN-γ細胞因子[8]。Th2細胞促進抗體產(chǎn)生,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,主要表達IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子[9]。 ELISA 檢測Grave病患者IL-6水平升高,說明Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在GD發(fā)病的有重要作用。此外檢測Graves病患者TNF-α細胞因子明顯升高,可能是pCD細胞增加引起的。IL-2顯著性降低,表明Th1介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答在Graves病發(fā)生作用較小,同時發(fā)現(xiàn)IFN-γ有所升高,但沒有明顯差異,IFN-γ主要是由Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生[10]。不同的淋巴細胞產(chǎn)生相同細胞因子,同一種淋巴細胞可以產(chǎn)生多種細胞因子,這些細胞因子間有著非常復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)作用,淋巴細胞及細胞因子間構(gòu)成了復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11-12]。免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失調(diào)導(dǎo)致自身免疫紊亂引發(fā)Graves病。

綜上所述,Graves病人中pDC和mDC水平升高,細胞因子分泌失調(diào),Th1/Th2失衡,從而導(dǎo)致機體自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

[1]中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會.中國甲狀腺疾病診治指南[J].中華內(nèi)科雜志,2007,46(10):876-882.

[2]Abraham P,Acharya S.Current and emerging treatment options for Graves'hyperthyroidism[J].Ther Clin Risk Manag,2010,6(2):29-40.

[3]Wei HF,Guan MP,Qin Y.Circulating levels of miR-146a and IL-17 are significantly correlated with the clinical activity of Graves'ophthalmopathy[J].Endocrine,2014,61(11):1087-1092.

[4]Sharma R,Li DZ.Role of dendritic cells in atherosclerosis[J].Asian cardiovascular thoracic annals,2006,14(2):166-169.

[5]謝謙,胡小平,張帆,等.198例甲亢及甲亢合并慢性蕁麻疹臨床分析[J].罕少疾病雜志,2010,17(6):18-21.

[6]Ma Y,Xu YC,Lei T,et al.Cytokine-induced killer(CIK)cell therapy for patients with hepatocellular carcinoma:efficacy and safety[J].Experimental Hematology Oncology,2012,1(11):169-178.

[7]謝曉雁,西爾娜依,郭婷,等.Graves'病和橋本氏甲減患者外周血Th1、Th2、Th17、Treg細胞的變化[J].放射免疫學(xué)雜志,2011,24(3):290-293.

[8]Hayashi F,Watanabe M,Nanba T,et a1.Association of the-31C/T function polymorphism in the interleukin-l beta gene witlI the intractability Graves'disease and the proportion T helper type 17 cells[J].Clin Exp lmmunol,2009,158(3):281-286.

[9]Nicte FV,Manuel AP.Increased circulating proInflammation cytokines and Th17 lymphocytes in hashimoto's thyroiditis[J].Clin Endocrinol Metab,2010,95(2):953-962.

[10]Youssef DM,Elbehidy RM.The influence of leptin on Th1/Th2 balance in obese children with asthma[J].Brasileiro Depneumologia,2013,39(5):562-568.

[11]Aamir IS,Tauheed S,Majid F,et al.Frequency of autoimmune thyroid disease in chronic urticaria[J].Coll Physicians Surg Pak,2010,20(3):158-161.

[12]Qin Q,Liu P,Liu L.The increased but non-predominant expression of Th17-and Th1-specific cytokines in Hashimoto's thyroiditis but not in Graves'disease[J].Medical and Biological Research,2012,45(12):1202-1208.

The Changes of the Peripheral Blood Dendritic Cells and Some Related Cytokines in Graves'Disease Patients

WU Jia,XIE Qian,ZHANG Ningbo,et al
(Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen,Guangdong 518036,China)

Objective To discuss the role of DC cells in Graves disease,we detect the frequency of different DC subsets and the secretion of cytokines in Graves patients'peripheral blood. Method Flow cytometry(FCM)was performed to assess the frequency of different DCsubsets in peripheral blood of 30 Graves patients and 30 healthy cases respectively.And ELISA was applied to detect the secretion of TNF-α,IFN-γ,IL-2 and IL-6 and other cytokines in the peripheral blood. Results The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease group was higher than that in healthy cases.And ELISA results showed that the secret of TNF-α,IFN-γ and IL-6 in Graves disease patients'peripheral blood were significant higher than that in normal control group,while IL-2 were significantly lower than the control group(P＜0.01).Conclusion The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease were higher than that of healthy controls,which indicated that pDC and mDC were involved in the pathogenesis of Graves.

Graves'disease; dendritic cells; cytokine

R581.3

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.008

2014-09-19;

2015-02-15

深圳市科技計劃項目(201201028,201203029);深圳市科技研發(fā)資金項目(JCYJ20120615085512920,JCYJ20140410164217365,ZYC201006180477A).

*通訊作者,E-mail:jianhui_yuan@126.com.

(此文編輯:朱雯霞)