朱 揚(yáng)，盧鐘嬌，傅 毅

(1.上海市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200011;2.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海200025)

隨著社會(huì)老年化的發(fā)展，無論在城市或農(nóng)村，因腦血管疾病入院的患者人數(shù)已領(lǐng)先于多種傳統(tǒng)高發(fā)病，在全死因順位中呈現(xiàn)出明顯前移的趨勢，特別在女性患者中其死亡率甚至超過惡性腫瘤和心臟病，居于首位。然而，腦梗死的發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，可能是受遺傳、環(huán)境和血管危險(xiǎn)因素共同作用的多因子復(fù)雜疾病[1]。已有孿生子和家系的研究表明，基因變異可通過影響常見危險(xiǎn)因素或通過調(diào)整危險(xiǎn)因素對(duì)終末靶器官的作用而直接影響腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)、梗死面積及預(yù)后[2]。因此，對(duì)于腦梗死可控制因素的預(yù)防是非常有必要的。

全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(genome wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)，人類染色體 9p21.3上參與細(xì)胞增殖調(diào)控的遺傳學(xué)區(qū)帶與心血管疾病的致病顯著相關(guān)，尤其是在白種人群，純合子變異能增加冠脈疾病(coronary artery disease，CAD)的發(fā)病率約40%[3-5]。而后續(xù)研究表明，該染色體上相同片段同樣也是腦梗死尤其是大動(dòng)脈硬化型腦梗死的易感區(qū)，這種遺傳重疊性最可能歸因于其共同的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制，并與已知的經(jīng)典致病通路有所不同，然而針對(duì)中國人群的研究甚少[6-7]。

隨著遺傳學(xué)研究手段的日趨完善，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)—高溫連接酶檢測反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCRLDR)[10]、選擇經(jīng)GWAS及Meta分析已證實(shí)的染色體9p21.3上的rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和 rs2383207 6個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的易感位點(diǎn)[8-13]，探討其與非心源性腦梗死發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，論證其在中國漢族人群中是否可作為上述血管硬化性疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選取2009年8月至2013年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、上海市第二人民醫(yī)院、閔行區(qū)中心醫(yī)院和公利醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院就診的急性腦梗死患者528例，包括無頸動(dòng)脈斑塊的患者153例，男96例，女57例，年齡為(56.56 ±7.65)歲;合并頸動(dòng)脈斑塊的患者375例，男256例，女119 例，年齡(60.90 ±6.24)歲。

所有入選腦梗死患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2010年頒布的中國急性缺血性腦卒中診治指南[14]，經(jīng)TOAST(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)分型[15]納入大動(dòng)脈硬化型腦梗死和腔隙性腦梗死2種亞型。入選標(biāo)準(zhǔn)為:(1)急性起病;(2)局灶性神經(jīng)功能缺損，少數(shù)為全面神經(jīng)功能缺損;(3)癥狀和體征持續(xù)數(shù)小時(shí)以上，且3 d以內(nèi);(4)腦磁共振顯示有責(zé)任病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)為:(1)心源性腦梗死;(2)腦CT或磁共振可見腦出血、占位病變、感染等顱內(nèi)病變;(3)冠心病、周圍血管疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能減退和甲狀腺功能異常等代謝性疾病;(4)有腦梗死家族遺傳史;(5)年齡超過70歲。用頸部血管多普勒超聲檢測頸動(dòng)脈斑塊形成情況[斑塊形成為頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(carotid intima-media thickness，IMT)≥1.5 mm 或有贅生物形成][16]。

258名正常對(duì)照者是同期來自各醫(yī)院的健康體檢者，其中男127名，女131名，年齡(56.34±7.85)歲，頭顱磁共振顯示無明顯異常并無頸動(dòng)脈斑塊存在。

根據(jù)既往研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素對(duì)70歲以下人群的影響更為顯著，因此我們將腦梗死組的年齡設(shè)定在70歲以下[17-18]。同時(shí)為了降低部分不可控制因素的影響，具體分析在不同年齡段人群中遺傳因素對(duì)疾病的作用差異，我們按照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)的劃分標(biāo)準(zhǔn)將入選對(duì)象歸類為青年人(＜45歲)、中年人(45～65歲)及老年人(＞65歲)3個(gè)年齡段。上述對(duì)象均為中國上海地區(qū)居住的漢族人，彼此無血緣關(guān)系;病前至少1個(gè)月未使用影響纖維蛋白溶解和凝血的藥物。

二、方法

所有被檢者禁食12 h，晨起空腹抽取靜脈血5 mL，在乙二胺四乙酸抗凝管中混勻，其中2 mL用作DNA提取;另3 mL靜脈血分離作血清血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)測定，并記錄血壓和相關(guān)臨床資料。

采用酚氯仿法提取全血基因組DNA，通過引物設(shè)計(jì)軟件Primer Express、Oligo進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，見表1，再經(jīng)PCR-LDR檢測并進(jìn)行基因分型。

多重PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)總體積為20μL，包括 2μL 1× buffer，3 mmol/L Mg2+0.6μL，2 mmol/L dNTP，上、下游引物(50 ng/L)各 2μL，DNA模板50 ng，Taq DNA聚合酶1 U。擴(kuò)增步驟:95℃預(yù)變性120 s，然后按94℃ 30 s、50℃90 s、65℃ 60 s共35循環(huán)，最后65℃延長至10 min;循環(huán)結(jié)束后，取2μL反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

多重LDR反應(yīng):LDR反應(yīng)總體積為10μL，包含1μL 1×buffer、probe 各 2 pmol/μL、PCR 產(chǎn)物4μL、NEB Taq DNA連接酶2 U。反應(yīng)循環(huán)參數(shù):95℃ 預(yù)變性120 s，然后按94℃ 15 s、50℃25 s共40循環(huán)。后各取1μL LDR連接產(chǎn)物與1μL ABI GS-500 ROX熒光標(biāo)記相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，置于冰水混合物上急速冷卻。

表1 6個(gè)位點(diǎn)的基因庫號(hào)、引物序列和PCR產(chǎn)物長度

LDR產(chǎn)物測序電泳并分析:使用PRISM 3730型DNA測序儀，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中進(jìn)行 3 000 V毛細(xì)管電泳 2.5 h;采用GENESCANTM672軟件、Genemapper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集并進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)的基因分型。

PCR產(chǎn)物核苷酸序列測定:隨機(jī)選取上述染色體9p21.3片段6個(gè)位點(diǎn)的野生型、純合和雜合變異型PCR產(chǎn)物各2例，由上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司直接測序驗(yàn)證。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，先行單因素分析篩查可能的危險(xiǎn)因素變量再引入多因素分析。計(jì)量資料的比較采用正態(tài)分布性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)于正態(tài)分布資料，使用t檢驗(yàn);對(duì)于偏態(tài)分布資料，使用Mann-Whitney U法檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算等位基因和基因型頻率。再通過多元Logistic回歸模型分析校正年齡、性別、高血壓等暴露因素后的比值比(odds ratio，OR)及 95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的位點(diǎn)探討基因交互作用。統(tǒng)計(jì)效能，α雙側(cè)=0.05。同時(shí)用SHEsis軟件行配對(duì)連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)檢驗(yàn)計(jì)算 D'(Lewomin系數(shù))，當(dāng) D'＞0.7時(shí)認(rèn)為存在強(qiáng)的連鎖不平衡[19]。

結(jié) 果

一、染色體9p21.3片段6個(gè)位點(diǎn)的基因測序

染色體9p21.3片段6個(gè)位點(diǎn)的rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和rs2383207野生型、純合型和雜合變異型的基因測序圖見圖1～6。

圖1 rs10757278位點(diǎn)基因測序圖

圖2 rs1333049位點(diǎn)基因測序圖

圖3 rs2383206位點(diǎn)基因測序圖

圖4 rs1537378位點(diǎn)基因測序圖

圖5 rs4977574位點(diǎn)基因測序圖

圖6 rs2383207基因測序圖

二、背景特征

無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死患者相比正常對(duì)照人群的高血壓患病率、血壓(收縮壓、舒張壓)參數(shù)明顯升高(P＜0.05)，而平均年齡構(gòu)成、血脂、血糖水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P＞0.05)。同時(shí)對(duì)所有腦梗死患者的資料分析發(fā)現(xiàn)，有頸動(dòng)脈斑塊者的高血壓、糖尿病患病率較無斑塊者增加(P＜0.05)，特別是年齡、收縮壓和HDL-C的平均水平在二組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。建立多元逐步回歸模型后也發(fā)現(xiàn)男性和舒張壓升高的個(gè)體更易發(fā)生腦梗死(P＜0.05)，高齡和HDL-C水平下降與頸動(dòng)脈斑塊的發(fā)生明顯相關(guān)(P＜0.05)。見表2。

表2 腦梗死患者和正常對(duì)照者的一般資料

三、無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死組和正常對(duì)照組之間9p21 6個(gè)位點(diǎn)基因分型分布

Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究群體在各基因位點(diǎn)上的分布頻率均符合遺傳平衡，具有群體代表性，且經(jīng)LDR均檢測出野生型、純合和雜合變異型3種基因型。無論是在＜45歲還是超過65歲2個(gè)年齡段，相對(duì)于正常對(duì)照組，9p21區(qū)帶上rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和 rs2383207 的等位基因頻率分布在無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而在中年人群中，無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死組rs2383206和rs4977574的G等位基因攜帶人數(shù)顯著增加(分別為55.0%和 54.2%)，明顯多于正常對(duì)照組(分別為 45.9% 和 44.4%，P=0.024、0.015)，但在其余4個(gè)位點(diǎn)卻未發(fā)現(xiàn)有意義的結(jié)論。并且經(jīng)多元Logistic回歸模型計(jì)算，在校正年齡、性別及高血壓等傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，仍然可在rs2383206和rs4977574 2個(gè)位點(diǎn)得到同 樣 的結(jié) 果 (P=0.021、0.013)。其 中，rs2383206、rs4977574的G等位基因攜帶者的腦梗死易感性比A等位基因攜帶者分別高出0.472 和0.519 倍(OR=1.472，95%CI為1.060 ～2.044;OR=1.519，95%CI為1.094 ～2.110)，見表3。同時(shí)對(duì)基因型研究后發(fā)現(xiàn)，腦梗死組中rs2383206、rs4977574的 GG基因型的分布頻率(分別為31.1%和29.4%)均高于正常對(duì)照組(分別為20.5%和19.0%)，也以中年人群的差異為主(P=0.059、0.038)。

表3 無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死組和正常對(duì)照組之間的等位基因頻率分布 [例(%)]

四、中年人群2個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合分析和6個(gè)位點(diǎn)的連鎖分析

對(duì)于多因子復(fù)雜疾病，單個(gè)基因位點(diǎn)的作用可能僅僅是微效性的表現(xiàn)，故多基因的聯(lián)合和連鎖分析是必不可少的研究手段[20]。為此，我們進(jìn)一步分析了在中年人群有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的rs2383206和rs4977574 2個(gè)位點(diǎn)的基因聯(lián)合作用。同時(shí)攜帶GG純合子的個(gè)體在無頸動(dòng)脈斑塊的腦梗死組有26.1%，而正常對(duì)照組只有17.8%(P=0.030)，提示2個(gè)位點(diǎn)同時(shí)攜帶非GG純合突變基因型(GA+AA)的個(gè)體發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)低于同時(shí)含有GG純合突變基因型的個(gè)體，可能是其易感性的0.577倍，而其中只有一個(gè)位點(diǎn)攜帶A等位基因(GA+AA)的個(gè)體，在群體中的分布僅為個(gè)位數(shù)，未發(fā)現(xiàn)在兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表4。另外經(jīng)過 SHEsis軟件分析，選取的9p21區(qū)帶上的6個(gè)位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡關(guān)系(D'=0.85 ～0.99)。見圖1。

表4 45～65歲人群校正后的rs2383206和rs4977574 2個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合分析

圖7 9p21區(qū)帶上的6個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡

討 論

本研究檢測了染色體9p21區(qū)帶上既往已被報(bào)道的與CAD/心肌梗死發(fā)病易感相關(guān)、距離約64 kb的 6個(gè)位點(diǎn)的 SNP。我們發(fā)現(xiàn)，SNP rs2383206、rs4977574的G等位基因在中年人群中表現(xiàn)出腦梗死的易感性，而其余4個(gè)位點(diǎn)的SNP與腦梗死的相關(guān)性在中國漢族人群中并不明確。

rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207這6個(gè)位點(diǎn)集中在9號(hào)染色體長臂21.3區(qū)域一段長約100 kb的 DNA序列內(nèi)，與2個(gè)已知的抑癌基因——細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitors 2A，CDKN2A)和 CDKN2B處于同一連鎖不平衡結(jié)構(gòu)域中。CDKN2A和CDKN2B分別編碼CDK4(INK4)家族中的p16INK4a和p15INK4b及一個(gè)與家族抑制子完全無關(guān)的蛋白p14ARF，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、衰老及凋亡都起著重要作用，并能誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，可能與既往造成動(dòng)脈粥樣硬化的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的發(fā)生機(jī)制有所不同[21-22]。同時(shí)，如果靶向敲除小鼠4號(hào)染色體上70 kb的9p21.3區(qū)域同源重復(fù)序列基因，發(fā)現(xiàn)突變小鼠中CDKN2A和CDKN2B的表達(dá)明顯減少，主動(dòng)脈平滑肌的增殖能力增加了一倍，這與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生息息相關(guān)[23]。

在本研究中，我們前期篩選了大約800例的急性腦梗死患者，前瞻性地剔除了頸動(dòng)脈斑塊這一危險(xiǎn)因素對(duì)于腦梗死發(fā)生可能的影響，僅將無頸動(dòng)脈斑塊的急性腦梗死患者作為病例組納入分析，并通過多元Logistic回歸校正相關(guān)危險(xiǎn)因素，加入SNP性聯(lián)合分析。從而得出，在研究對(duì)象人數(shù)分布最多的45～65歲這個(gè)年齡段，染色體9p21的SNP(rs2383206、rs4977574)與急性腦梗死的易感性相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，我們選取的9p21區(qū)帶上的6個(gè)位點(diǎn)之間存在較強(qiáng)的連鎖不平衡關(guān)系，其中有臨床意義的2個(gè)位點(diǎn)突變型在對(duì)腦梗死的發(fā)病上表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，有可能對(duì)相關(guān)疾病的發(fā)生有疊加作用，更加容易發(fā)生腦梗死，進(jìn)而提示通過遺傳學(xué)手段實(shí)現(xiàn)對(duì)腦梗死早期干預(yù)的重要性，特別是在社會(huì)的主力軍——中年群體尤為重要。此外，我們?nèi)虢M的急性腦梗死患者都排除了心源性腦梗死亞型，降低了心源性因素對(duì)本研究的影響，進(jìn)一步說明了9p21相關(guān)位點(diǎn)的SNP對(duì)于腦梗死的發(fā)生有其獨(dú)特的作用機(jī)制，這也間接解釋了我們的結(jié)果可能與其他研究的不一致。

近來HU等[23]對(duì)中國北方人群的研究發(fā)現(xiàn)，SNP rs2383206 GG/GA攜帶者發(fā)生大動(dòng)脈硬化型腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)較AA純合子明顯增加(P=0.002);同時(shí)瑞士學(xué)者根據(jù)(Coronary Artery Disease Genome-Wide Replication and Meta-Analysis Study，CARDIoGRAM)研究總結(jié)的25個(gè)CAD關(guān)聯(lián)SNP，對(duì)3 986例腦梗死患者和2 459名健康對(duì)照者進(jìn)行基因分型，特征性的發(fā)現(xiàn)染色體9p21.3上的SNP rs4977574與腦梗死的易感性相關(guān)(OR=1.12，95%CI:1.04 ～ 1.20，P=0.002)，尤其是在大動(dòng)脈硬化型腦梗死亞型中表現(xiàn)明顯(OR=1.36，95%CI:1.13 ～1.64，P=0.001)，這也進(jìn)一步提示了該位點(diǎn)可能是急性腦梗死易患因素的潛在意義[11]，均與我們的研究結(jié)果相似。從中可以看出，染色體9p21 rs2383206、rs4977574 2個(gè)位點(diǎn)的遺傳變異同樣可能是中國漢族人群發(fā)生急性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)因素。

總之，染色體9p21 rs2383206、rs4977574 2個(gè)位點(diǎn)的SNP與急性腦梗死的發(fā)生易感性有一定關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步明確該區(qū)帶與腦梗死的遺傳易感性及發(fā)病關(guān)聯(lián)，需要大樣本、多中心、多種族的研究證實(shí)。同時(shí)，后期研究應(yīng)注意細(xì)化卒中分型，統(tǒng)一相關(guān)入組標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各年齡段針對(duì)性的研究，降低樣本的選擇偏倚，并且重視遺傳與環(huán)境因素的交互作用，還可通過相關(guān)細(xì)胞和動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證。綜上所述，我們的研究結(jié)果可能為急性腦梗死的早期預(yù)防、個(gè)體化治療和相關(guān)遺傳學(xué)的機(jī)制研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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