石亞玲，趙 蓉，黃穎怡

(廣州市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510060)

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒 科，是影響全球公共衛(wèi)生的蚊傳播病原體。病毒基因編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(E、C、M)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)，根據(jù)包膜蛋白E抗原性可分為4種血清型(DENV-1～4)。該病毒通過感染性伊蚊叮咬向人類傳播。全球有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)曾發(fā)生過登革熱，亞洲東南部是登革熱高發(fā)區(qū)，例如我國(guó)廣東等東南部省市[1]。2014年廣東省登革熱的暴發(fā)性流行已造成3萬多人感染，6人死亡，使登革熱的防治重新受到人們重視。登革熱的典型特征是高熱、白細(xì)胞減少和血小板降低等，嚴(yán)重者會(huì)造成患者多組織或器官出血，甚至出現(xiàn)登革出血熱或登革休克綜合征。所以對(duì)疑似DENV感染患者快速準(zhǔn)確的診斷不僅能夠迅速隔離感染源，而且可以對(duì)患者及時(shí)治療，使登革熱的危害降到最低。目前國(guó)際上診斷登革熱的實(shí)驗(yàn)室方法主要是病毒檢測(cè)、病毒基因檢測(cè)、病毒抗原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)4種方法，但往往耗時(shí)，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作技術(shù)[2]。國(guó)內(nèi)也已經(jīng)有快速簡(jiǎn)便的膠體金免疫層析法 (gold immunochromatographic assay，GICA)檢測(cè)試劑盒，但尚未獲得批文。我們用GICA檢測(cè)發(fā)熱患者DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體，將檢測(cè)結(jié)果與聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)-熒光探針法的結(jié)果進(jìn)行比較。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象 2014年8至11月廣州市第八人民醫(yī)院就診的發(fā)熱患者血清樣本2 633例，患者年齡7個(gè)月～83歲，其中男1 327例，女1 306例。健康體檢人群樣本50例，流行性出血熱抗體陽性樣本5例，風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本4例。

2.試劑 DENV核酸檢測(cè)試劑由中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn);DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。

二、方法

采集患者血清，對(duì)樣本即時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。2 633例患者樣本均采用PCR-熒光探針法檢測(cè)DENV核酸。將2 633例患者樣本分為3組并采用GICA對(duì)DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體進(jìn)行檢測(cè):Ⅰ組為948例樣本，僅檢測(cè)NS1抗原;Ⅱ組為1 156例樣本，僅檢測(cè)IgG/IgM抗體;Ⅲ組為529例樣本，同時(shí)檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體。另50名健康體檢人群樣本、5例流行性出血熱抗體陽性樣本、4例風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本為Ⅳ組，采用GICA檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Ⅰ組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原檢測(cè)與PCR的陽性符合率為 89.09%(645/724)，陰性符合率為 92.41%(207/224)，總體符合率為 89.87%(852/948)。NS1抗原檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 948例樣本檢測(cè)病毒核酸和NS1抗原的結(jié)果

二、Ⅱ組檢測(cè)結(jié)果

DENV IgG/IgM抗體檢測(cè)與PCR的陽性符合率為64.68%(663/1 025)，陰性符合率為66.41%(87/131)，總體符合率為 64.88%(750/1 156)。IgG/IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 1 156例樣本檢測(cè)病毒核酸和IgG/IgM抗體的結(jié)果

三、Ⅲ組檢測(cè)結(jié)果

DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測(cè)與PCR的陽性符合率為93.56%(392/419)，陰性符合率為61.82%(68/110)，總體符合率為86.96%(460/529)。NS1抗原及IgG/IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 529例樣本檢測(cè)病毒核酸和NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結(jié)果

對(duì)419例PCR-熒光探針法檢測(cè)DENV核酸陽性的樣本，采用GICA聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原及IgG/IgM抗體，抗原和抗體相互間的結(jié)果為:NS1抗原陽性樣本357例，IgG/IgM抗體陽性樣本265例，NS1抗原陽性和/或IgG/IgM抗體陽性樣本392例。見表4。NS1抗原陽性率為85.20%(357/419)，IgG/IgM 抗體陽性率為 63.25%(265/419)，NS1抗原和/或IgG/IgM抗體陽性符合率為93.57%(392/419)。

表4 419例DENV核酸陽性樣本檢測(cè)NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結(jié)果

四、Ⅳ組檢測(cè)結(jié)果

采用GICA聯(lián)合檢測(cè)NS1抗原及IgG/IgM抗體，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，特異性為100%。

討 論

DENV感染是一種系統(tǒng)性和功能性疾病。病毒感染后潛伏期為1～14 d，一般為5～9 d。潛伏期后病情變化迅猛，隨后進(jìn)入3個(gè)時(shí)期:急性發(fā)熱期、極期和恢復(fù)期[3]，可引起一系列的臨床癥狀。雖然目前沒有針對(duì)DENV特效的抗病毒藥物，但是感染者往往在及時(shí)的診斷和合理的對(duì)癥治療后能夠康復(fù)。所以，無論是從感染者及時(shí)得到合理治療，還是從第一時(shí)間隔離傳染源出發(fā)，首先就要求臨床實(shí)驗(yàn)室能夠提供快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，以供臨床診斷參考。

目前針對(duì)DENV檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室4種診斷方法各具優(yōu)勢(shì)及局限性。病毒檢測(cè)主要是通過將患者樣本接種于蚊蟲細(xì)胞(如c6/36和AP61細(xì)胞系)或乳鼠內(nèi)共培養(yǎng)后使樣本內(nèi)病毒進(jìn)入蚊蟲細(xì)胞或小鼠體內(nèi)從而達(dá)到病毒分離的目的。這種方法特異性高，能夠?qū)Ω腥具M(jìn)行確定性診斷，并且還能夠確定病毒血清型，但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格高，對(duì)樣本和實(shí)驗(yàn)設(shè)備也有特定要求，在普通臨床實(shí)驗(yàn)室中較難實(shí)現(xiàn)[4]。病毒基因檢測(cè)則是通過PCR對(duì)樣本內(nèi)的病毒基因進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)，這種方法具有很高的敏感性和特異性，能夠在24～48 h內(nèi)完成檢測(cè)，但這種方法很可能受到樣本中其它基因的干擾而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[5]，需要專業(yè)知識(shí)和貴重實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，價(jià)格昂貴，上述2種方法都無法區(qū)分初次和二次感染?？乖瓩z測(cè)主要是用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)針對(duì)病毒中NS1抗原檢測(cè)，這是相對(duì)與病毒分離和基因檢測(cè)方法較為方便、快速的方法，但其敏感性和特異性均不理想，許多研究已經(jīng)報(bào)道ELISA法檢測(cè)NS1的效應(yīng)[6]。血清學(xué)檢測(cè)是對(duì)感染者體內(nèi)的IgM、IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，可區(qū)分初次和二次感染。IgM抗體是初次感染者體內(nèi)出現(xiàn)的主要抗體，在感染者發(fā)熱的第3～5天可出現(xiàn)，至第10～20天99%的患者都可以檢測(cè)到IgM抗體[7];IgG則是二次感染者體內(nèi)出現(xiàn)的主要抗體，所以IgG檢測(cè)可以用來判斷患者是初次感染還是再次感染。目前對(duì)IgM、IgG的檢測(cè)仍以ELISA為主，國(guó)外已有檢測(cè)IgM的包括微粒凝集法和橫向?qū)游鲈嚰垪l在內(nèi)的快速檢測(cè)方法，并且可以針對(duì)不同血清型進(jìn)行檢測(cè)，但國(guó)內(nèi)均未獲得藥監(jiān)局批文。目前國(guó)外檢測(cè)IgM的快速膠體金的敏感性為21% ～99%，特異性為77% ～98%，與之相比，本研究所選用的DENV IgM、IgG檢測(cè)板敏感性居中而特異性偏低。但國(guó)外IgM試劑的敏感性和特異性是以ELISA為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算而來，我們是以基因檢測(cè)法為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算而來，所以若要比較國(guó)內(nèi)外DENV檢測(cè)試劑的效能仍需進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，GICA檢測(cè)NS1抗原試劑對(duì)DENV的檢測(cè)效能比核酸技術(shù)差，但優(yōu)于IgM、IgG抗體的檢測(cè)。究其原因，與核酸技術(shù)相比GICA使用的是免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)，免疫技術(shù)本身的局限性決定了其檢測(cè)的敏感性和特異性不如核酸檢測(cè)技術(shù);與IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑相比，兩者同樣使用的是抗原抗體反應(yīng)原理，但NS1在感染者體內(nèi)是相對(duì)單一的抗原[6]，且與NS1抗原反應(yīng)的抗體是單克隆抗體，而感染者體內(nèi)的IgM、IgG抗體多樣性決定了其交叉反應(yīng)性的存在，致使GICA檢測(cè)IgM、IgG抗體的效能降低。

雖然NS1抗原試劑的效能優(yōu)于IgM、IgG抗體試劑，但是DENV的IgM、IgG抗體檢測(cè)能夠一定程度上說明感染者是首次感染或二次感染，所以抗原檢測(cè)也不能夠完全替代抗體檢測(cè)。最佳方案則是將抗原和抗體檢測(cè)結(jié)合應(yīng)用，不僅能夠快速確診患者是否為DENV感染者，還能對(duì)其病程有一定提示。故我們將NS1抗原檢測(cè)和IgM、IgG抗體檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用后與核酸診斷進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)NS1抗原和IgG/IgM抗體聯(lián)合檢測(cè)的陽性符合率為93.56%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

本研究使用該試劑對(duì)流行性出血熱抗體陽性樣本、風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本及健康人群樣本進(jìn)行檢測(cè)，特異性為100%，說明該試劑對(duì)檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體結(jié)果無影響。

準(zhǔn)確、快速的床邊診斷一直是臨床實(shí)驗(yàn)室技術(shù)發(fā)展的方向。本研究結(jié)果顯示，GICA檢測(cè)NS1抗原和IgG/IgM抗體具有較高的敏感性和特異性，聯(lián)合應(yīng)用能夠?yàn)榕R床提供快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。但這2種試劑都不能夠?qū)ENV血清型進(jìn)行分型，這將不利于臨床對(duì)登革熱感染者病情預(yù)后的判斷，尤其是對(duì)DENV血清型為Ⅱ型的患者。我們只是初步分析這2種試劑的診斷效能，若要對(duì)其進(jìn)行全面評(píng)估則還需要通過更多的樣本檢測(cè)統(tǒng)計(jì)和效能評(píng)價(jià)指標(biāo)，希望自主研發(fā)試劑能夠更快、更好的發(fā)展，以推動(dòng)我國(guó)乃至全球?qū)嶒?yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展。

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