石亞玲，趙 蓉，黃穎怡

(廣州市第八人民醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510060)

登革熱病毒(Dengue virus，DENV)屬黃病毒 科，是影響全球公共衛(wèi)生的蚊傳播病原體。病毒基因編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(E、C、M)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)，根據(jù)包膜蛋白E抗原性可分為4種血清型(DENV-1～4)。該病毒通過感染性伊蚊叮咬向人類傳播。全球有100多個國家和地區(qū)曾發(fā)生過登革熱，亞洲東南部是登革熱高發(fā)區(qū)，例如我國廣東等東南部省市[1]。2014年廣東省登革熱的暴發(fā)性流行已造成3萬多人感染，6人死亡，使登革熱的防治重新受到人們重視。登革熱的典型特征是高熱、白細胞減少和血小板降低等，嚴(yán)重者會造成患者多組織或器官出血，甚至出現(xiàn)登革出血熱或登革休克綜合征。所以對疑似DENV感染患者快速準(zhǔn)確的診斷不僅能夠迅速隔離感染源，而且可以對患者及時治療，使登革熱的危害降到最低。目前國際上診斷登革熱的實驗室方法主要是病毒檢測、病毒基因檢測、病毒抗原檢測和血清學(xué)檢測4種方法，但往往耗時，有的需要昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的操作技術(shù)[2]。國內(nèi)也已經(jīng)有快速簡便的膠體金免疫層析法 (gold immunochromatographic assay，GICA)檢測試劑盒，但尚未獲得批文。我們用GICA檢測發(fā)熱患者DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體，將檢測結(jié)果與聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)-熒光探針法的結(jié)果進行比較。

材料和方法

一、材料

1.研究對象 2014年8至11月廣州市第八人民醫(yī)院就診的發(fā)熱患者血清樣本2 633例，患者年齡7個月～83歲，其中男1 327例，女1 306例。健康體檢人群樣本50例，流行性出血熱抗體陽性樣本5例，風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本4例。

2.試劑 DENV核酸檢測試劑由中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn);DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測試劑由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。

二、方法

采集患者血清，對樣本即時進行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。2 633例患者樣本均采用PCR-熒光探針法檢測DENV核酸。將2 633例患者樣本分為3組并采用GICA對DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體進行檢測:Ⅰ組為948例樣本，僅檢測NS1抗原;Ⅱ組為1 156例樣本，僅檢測IgG/IgM抗體;Ⅲ組為529例樣本，同時檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。另50名健康體檢人群樣本、5例流行性出血熱抗體陽性樣本、4例風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本為Ⅳ組，采用GICA檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Ⅰ組檢測結(jié)果

DENV NS1抗原檢測與PCR的陽性符合率為 89.09%(645/724)，陰性符合率為 92.41%(207/224)，總體符合率為 89.87%(852/948)。NS1抗原檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 948例樣本檢測病毒核酸和NS1抗原的結(jié)果

二、Ⅱ組檢測結(jié)果

DENV IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為64.68%(663/1 025)，陰性符合率為66.41%(87/131)，總體符合率為 64.88%(750/1 156)。IgG/IgM抗體檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 1 156例樣本檢測病毒核酸和IgG/IgM抗體的結(jié)果

三、Ⅲ組檢測結(jié)果

DENV NS1抗原和/或IgG/IgM抗體檢測與PCR的陽性符合率為93.56%(392/419)，陰性符合率為61.82%(68/110)，總體符合率為86.96%(460/529)。NS1抗原及IgG/IgM抗體檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 529例樣本檢測病毒核酸和NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結(jié)果

對419例PCR-熒光探針法檢測DENV核酸陽性的樣本，采用GICA聯(lián)合檢測NS1抗原及IgG/IgM抗體，抗原和抗體相互間的結(jié)果為:NS1抗原陽性樣本357例，IgG/IgM抗體陽性樣本265例，NS1抗原陽性和/或IgG/IgM抗體陽性樣本392例。見表4。NS1抗原陽性率為85.20%(357/419)，IgG/IgM 抗體陽性率為 63.25%(265/419)，NS1抗原和/或IgG/IgM抗體陽性符合率為93.57%(392/419)。

表4 419例DENV核酸陽性樣本檢測NS1抗原和/或IgG/IgM抗體的結(jié)果

四、Ⅳ組檢測結(jié)果

采用GICA聯(lián)合檢測NS1抗原及IgG/IgM抗體，檢測結(jié)果均為陰性，特異性為100%。

討 論

DENV感染是一種系統(tǒng)性和功能性疾病。病毒感染后潛伏期為1～14 d，一般為5～9 d。潛伏期后病情變化迅猛，隨后進入3個時期:急性發(fā)熱期、極期和恢復(fù)期[3]，可引起一系列的臨床癥狀。雖然目前沒有針對DENV特效的抗病毒藥物，但是感染者往往在及時的診斷和合理的對癥治療后能夠康復(fù)。所以，無論是從感染者及時得到合理治療，還是從第一時間隔離傳染源出發(fā)，首先就要求臨床實驗室能夠提供快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，以供臨床診斷參考。

目前針對DENV檢測的實驗室4種診斷方法各具優(yōu)勢及局限性。病毒檢測主要是通過將患者樣本接種于蚊蟲細胞(如c6/36和AP61細胞系)或乳鼠內(nèi)共培養(yǎng)后使樣本內(nèi)病毒進入蚊蟲細胞或小鼠體內(nèi)從而達到病毒分離的目的。這種方法特異性高，能夠?qū)Ω腥具M行確定性診斷，并且還能夠確定病毒血清型，但這種方法耗時長、價格高，對樣本和實驗設(shè)備也有特定要求，在普通臨床實驗室中較難實現(xiàn)[4]。病毒基因檢測則是通過PCR對樣本內(nèi)的病毒基因進行擴增后檢測，這種方法具有很高的敏感性和特異性，能夠在24～48 h內(nèi)完成檢測，但這種方法很可能受到樣本中其它基因的干擾而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[5]，需要專業(yè)知識和貴重實驗室設(shè)備，價格昂貴，上述2種方法都無法區(qū)分初次和二次感染?？乖瓩z測主要是用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)針對病毒中NS1抗原檢測，這是相對與病毒分離和基因檢測方法較為方便、快速的方法，但其敏感性和特異性均不理想，許多研究已經(jīng)報道ELISA法檢測NS1的效應(yīng)[6]。血清學(xué)檢測是對感染者體內(nèi)的IgM、IgG抗體進行檢測，可區(qū)分初次和二次感染。IgM抗體是初次感染者體內(nèi)出現(xiàn)的主要抗體，在感染者發(fā)熱的第3～5天可出現(xiàn)，至第10～20天99%的患者都可以檢測到IgM抗體[7];IgG則是二次感染者體內(nèi)出現(xiàn)的主要抗體，所以IgG檢測可以用來判斷患者是初次感染還是再次感染。目前對IgM、IgG的檢測仍以ELISA為主，國外已有檢測IgM的包括微粒凝集法和橫向?qū)游鲈嚰垪l在內(nèi)的快速檢測方法，并且可以針對不同血清型進行檢測，但國內(nèi)均未獲得藥監(jiān)局批文。目前國外檢測IgM的快速膠體金的敏感性為21% ～99%，特異性為77% ～98%，與之相比，本研究所選用的DENV IgM、IgG檢測板敏感性居中而特異性偏低。但國外IgM試劑的敏感性和特異性是以ELISA為標(biāo)準(zhǔn)計算而來，我們是以基因檢測法為標(biāo)準(zhǔn)計算而來，所以若要比較國內(nèi)外DENV檢測試劑的效能仍需進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，GICA檢測NS1抗原試劑對DENV的檢測效能比核酸技術(shù)差，但優(yōu)于IgM、IgG抗體的檢測。究其原因，與核酸技術(shù)相比GICA使用的是免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)，免疫技術(shù)本身的局限性決定了其檢測的敏感性和特異性不如核酸檢測技術(shù);與IgM、IgG抗體檢測試劑相比，兩者同樣使用的是抗原抗體反應(yīng)原理，但NS1在感染者體內(nèi)是相對單一的抗原[6]，且與NS1抗原反應(yīng)的抗體是單克隆抗體，而感染者體內(nèi)的IgM、IgG抗體多樣性決定了其交叉反應(yīng)性的存在，致使GICA檢測IgM、IgG抗體的效能降低。

雖然NS1抗原試劑的效能優(yōu)于IgM、IgG抗體試劑，但是DENV的IgM、IgG抗體檢測能夠一定程度上說明感染者是首次感染或二次感染，所以抗原檢測也不能夠完全替代抗體檢測。最佳方案則是將抗原和抗體檢測結(jié)合應(yīng)用，不僅能夠快速確診患者是否為DENV感染者，還能對其病程有一定提示。故我們將NS1抗原檢測和IgM、IgG抗體檢測聯(lián)合應(yīng)用后與核酸診斷進行比較，發(fā)現(xiàn)NS1抗原和IgG/IgM抗體聯(lián)合檢測的陽性符合率為93.56%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

本研究使用該試劑對流行性出血熱抗體陽性樣本、風(fēng)疹/麻疹抗體陽性樣本及健康人群樣本進行檢測，特異性為100%，說明該試劑對檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體結(jié)果無影響。

準(zhǔn)確、快速的床邊診斷一直是臨床實驗室技術(shù)發(fā)展的方向。本研究結(jié)果顯示，GICA檢測NS1抗原和IgG/IgM抗體具有較高的敏感性和特異性，聯(lián)合應(yīng)用能夠為臨床提供快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。但這2種試劑都不能夠?qū)ENV血清型進行分型，這將不利于臨床對登革熱感染者病情預(yù)后的判斷，尤其是對DENV血清型為Ⅱ型的患者。我們只是初步分析這2種試劑的診斷效能，若要對其進行全面評估則還需要通過更多的樣本檢測統(tǒng)計和效能評價指標(biāo)，希望自主研發(fā)試劑能夠更快、更好的發(fā)展，以推動我國乃至全球?qū)嶒炇以\斷技術(shù)的發(fā)展。

[1]GUZMAN MG，KOURI G.Dengue:an update[J].Lancet Infect Dis，2002，2(1):33-42.

[2]HUNSPERGER EA，YOKSAN S，BUCHY P，et al.Evaluation of commercially available diagnostic tests for the detection of Dengue virus NS1 antigen and anti-Dengue virus IgM antibody[J].PLoS Negl Trop Dis，2014，8(10):e3171.

[3]國衛(wèi)發(fā)明電〔2014〕66號.登革熱診療指南(2014年第2版)[S].

[4]SHU PY，HUANG JH.Current advances in dengue diagnosis[J].Clin Diagn Lab Immunol，2004，11(4):642-650.

[5]LEVI JE，TATENO AF，MACHADO AF，et al.Evaluation of a commercial real-time PCR kit for detection of Dengue virus in samples collected during an outbreak in Goiania，Central Brazil，in 2005[J].J Clin Microbiol，2007，45(6):1893-1897.

[6]MCBRIDE WJ.Evaluation of dengue NS1 test kits for the diagnosis of dengue fever[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2009，64(1):31-36.

[7]KUNO G，GOMEZ I，GUBLER DJ. An ELISA procedure for the diagnosis of dengue infections[J].J Virol Methods，1991，33(1-2):101-113.