鄭衛(wèi)波，許文芳，李燁佳

(紹興市第六人民醫(yī)院檢驗科，浙江紹興312000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染具有明顯的地理差異，HBV基因異質(zhì)性可以影響乙型肝炎的臨床和流行病學(xué)特點、疾病的預(yù)后、抗病毒治療的應(yīng)答以及病毒的變異，從而使乙型肝炎的防治面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究采用型特異性聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，對紹興地區(qū)抗病毒治療的乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的HBV基因型流行情況進(jìn)行初步調(diào)查，以明確本地區(qū)HBV基因型的分布情況，探討經(jīng)抗病毒治療的不同HBV基因型感染者的臨床特點，以期為臨床診斷及指導(dǎo)臨床抗HBV藥物治療提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.研究對象 122例病例均為2009年1月至2012年6月在紹興市第六人民醫(yī)院住院或門診就診的 CHB患者，男85例，女 37例，年齡(41.2±18.7)歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù) 2005 年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會與感染病學(xué)分會聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[1]。納入標(biāo)準(zhǔn):HBeAg陽性且HBV DNA≥103拷貝/mL。排除標(biāo)準(zhǔn):排除甲型、丙型、丁型、戊型病毒的感染，排除自身免疫性肝炎、脂肪肝和酒精肝，入組前未使用過核苷類似物和干擾素等抗病毒藥物及免疫調(diào)節(jié)劑。入組的乙型肝炎患者給予拉米夫定100 mg/d口服抗病毒治療并進(jìn)行跟蹤隨訪，隨訪時間為1年，所有患者對拉米夫定均有較好的依從性。慢性乙型輕、中和重度肝炎分類依據(jù)2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[2]。

2.標(biāo)本采集 使用干燥真空管采集患者空腹靜脈血5 mL，將分離的血清按規(guī)定的要求凍存在冰箱待測。

3.儀器和試劑 德國ROCHE Lightcycle 480熒光PCR定量儀，美國雅培ARCHITECH I 2000化學(xué)發(fā)光儀，德國西門子ADVIA 2400生化分析儀，美國BIO-RAD S1000Thermal Cycler PCR儀，德國QIAGEN PyroMark Q96 ID測序儀，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transferase，ALT)、HBeAg及HBV基因測序試劑盒均為原裝配套試劑，HBV PCR熒光定量檢測試劑盒為湖南圣湘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，HBV DNA提取試劑盒為上海復(fù)星醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，引物由上海英駿生物公司合成。

二、方法

1.血清學(xué)檢測 采用熒光定量PCR檢測HBV DNA，檢測按試劑盒操作說明書進(jìn)行，HBV DNA≥103拷貝/mL判定為陽性。采用化學(xué)發(fā)光法檢測HBeAg，速率法檢測ALT。

2.HBV基因分型 采用多對型特異性引物巢式PCR對HBV作基因分型，通過巢式PCR擴增處理，將PCR產(chǎn)物分別在3%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，同時加入低相對分子質(zhì)量Marker，根據(jù)電泳條帶的長度來確定基因型，A、B、C、D、E、F 6 種HBV基因分型電泳條帶的長度分別為68、281、122、119、167 和 97 bp。

3.HBV耐藥基因檢測 所有患者在出現(xiàn)拉米夫定耐藥后均進(jìn)行HBV P基因測序，采用焦磷酸測序法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，采用PyroMark ID型焦磷酸測序儀配套的分析軟件進(jìn)行序列分析，本研究檢測HBV P基因RT區(qū)已知的11個耐藥基因位點:V173L、T184A/G/I/S/L/F、S202G/V/C/I、N236T、M250V/L/I、M204I/V、L180M、I233V、I169T、A194T/M 和 A181V/T。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用 χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、122例CHB患者基因分型情況

122例拉米夫定抗病毒治療的CHB患者中，B基因型 34例(27.87%)，C基因型 82例(67.21%)，D 基因型3 例(2.45%)，C/D 混合基因基因型1例(0.82%)，B/C混合基因型2例(1.64%)，無其它基因型存在。

二、B、C基因型與年齡、性別、傳播途徑的關(guān)系

C基因型感染者年齡為(42.85±12.31)歲，B基因型感染者年齡為(42.53±14.55)歲，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.14，P＞0.05)。82例 C基因型感染者中男62例，女20例，34例B基因型感染者中男27例，女7例，其它基因型感染者男5例，女1例，B基因型組與C基因型組比較，性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.20，P ＞0.05)。82例C基因型感染者中，明確有乙型肝炎家族史者56例，傳播途徑不詳者26例，B基因型感染者中明確有家族史者19例，其它傳播途徑不詳者15例。

三、HBV基因型與臨床表現(xiàn)分析

抗病毒治療后CHB患者中，輕度CHB在B、C基因型感染者中分別占 44.12%和14.63%(χ2=11.7，P ＜ 0.01);中度 CHB 在B、C基因型感染者中分別占 11.76%和19.51%(χ2=1.01，P ＞0.05)，重度 CHB 在B、C基因型感染者中分別占 11.76%和13.41%(χ2=0.06，P ＞0.05);肝硬化代償期在B、C基因型感染者中分別占 17.65% 和17.07%(χ2=0.01，P ＞0.05)，肝硬化失代償期在B、C基因型感染者中分別占11.76% 和30.49%(χ2=4.49，P ＜0.05);肝癌在 B、C 基因型感染者中分別占 2.94%和 4.88%(χ2=0.219，P ＞0.05)。見表 1。

表1 CHB患者HBV基因型與臨床表現(xiàn)的關(guān)系 (例)

四、B、C基因型感染者血清HBeAg轉(zhuǎn)陰率、ALT復(fù)常率及HBV DNA轉(zhuǎn)陰率的比較

122例患者中由于B、C基因型以外的其它基因型例數(shù)較少，故不將其它基因型納入分析比較。經(jīng)統(tǒng)計分析，B基因型感染者HBeAg轉(zhuǎn)陰率、HBV DNA轉(zhuǎn)陰率顯著高于C基因型感染者(χ2=8.04、11.9，P 均 ＜0.01)，ALT 復(fù)常率高于C基因型感染者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.62，P ＞0.05)。B、C 基因型感染者治療前血清HBV DNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.89，P=0.38)?？共《局委?1 年后，B基因型感染者HBV DNA載量顯著低于C基因型感染者(t=2.71，P=0.022)。見表 2、表 3。

五、抗病毒治療后HBV P基因變異分析

B基因型感染者抗病毒治療1年內(nèi)HBV P基因發(fā)生變異0例，C基因型感染者發(fā)生變異4例，檢測到rtM204I/V、rtL180M單位點的變異，其中檢出 rtM204I/V突變2例，占50%，rtM204I/V+rtL180M突變2例，占50%，其它基因型感染者有1例發(fā)生rtM204I/V+rtL180M突變，B基因型和C基因型感染者1年內(nèi)HBV P基因變異率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.71，P ＞0.05)。

表2 不同HBV基因型感染者HBeAg轉(zhuǎn)陰率、ALT復(fù)常率的比較

表3 不同HBV基因型感染者治療前后HBV DNA檢測結(jié)果

討 論

根據(jù)HBV基因序列不同，目前HBV可分為A～J共10種基因型[3-4]。我國HBV基因型南方以B基因型為主，北方以C基因型為主，D基因型僅見于西部及少數(shù)民族地區(qū)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)122例抗病毒治療的CHB患者主要以C基因型和B基因型為主，C基因型占優(yōu)勢，并出現(xiàn)了一定比例的D基因型，這與北京地區(qū)HBV基因型分布情況基本相似[5]，這可能與入選治療標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，而D基因型的出現(xiàn)，可能是西部及少數(shù)民族人口向東部沿海城市流動增強所致。

有學(xué)者對亞洲地區(qū)普遍流行的B基因型和C基因型作了大量研究，結(jié)果顯示，與B基因型相比，C基因型患者HBeAg血清轉(zhuǎn)換率低[6]，CHB病情重，發(fā)展為肝硬化和肝癌的可能性亦較大[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，B基因型患者以輕度CHB為主，C基因型患者以失代償期肝硬化為主，提示B基因型的預(yù)后好于C基因型;與以往文獻(xiàn)報道有所差異的是，本研究中82例C基因型和34例B基因型患者中肝癌所占比例均較少，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能一方面與入選的病例有關(guān)，另一方面可能是CHB患者早期積極的抗病毒治療在一定程度上抑制了疾病的發(fā)展。數(shù)據(jù)顯示B基因型感染患者抗病毒治療1年后不僅HBV DNA轉(zhuǎn)陰率、HBeAg轉(zhuǎn)陰率以及ALT復(fù)常率均高于C基因型，而且HBV DNA載量顯著低于C基因型感染患者，說明B基因型較C基因型具有較強的免疫應(yīng)答能力，C基因型病毒致病性強，容易導(dǎo)致感染者免疫耐受。同時我們還發(fā)現(xiàn)，其它基因型組中HBV DNA轉(zhuǎn)陰率、HBeAg轉(zhuǎn)陰人數(shù)以及ALT的復(fù)常率均較低，6例患者中有3例為混合基因型，而混合感染者較單一基因型感染嚴(yán)重，可能2種基因?qū)Ω闻K的損害具有協(xié)同累加作用[8]。

國內(nèi)外一些研究表明，HBV基因異質(zhì)性與疾病進(jìn)展及藥物應(yīng)答有相關(guān)性，基因B型HBV對拉米夫定的應(yīng)答率優(yōu)于C型，而YMDD變異發(fā)生率低于 C型，認(rèn)為 YMDD變異呈現(xiàn)基因選擇性[9-10]。本研究的34例B基因型和82例C基因型患者抗病毒治療1年后，B基因型無1例發(fā)生病毒變異，而C基因型有4例發(fā)生了基因突變，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，此結(jié)果與石銘等[11]的報道基本相同。有文獻(xiàn)報道拉米夫定耐藥株感染者基因型與YMDD變異模式無關(guān)[12]，而與變異位點具有一定的相關(guān)性[13]。本研究顯示，HBV P位點突變主要在204、180位點，并出現(xiàn)高比例聯(lián)合突變，表明rtM204I/V是拉米夫定耐藥性相關(guān)的主要突變位點，且多伴隨rtL180M的聯(lián)合突變，這與盧丹等[13]耐藥突變分析結(jié)果大致相似。

拉米夫定抗病毒藥物是臨床上使用較早和較廣泛的核苷類藥物，所以加強對HBV基因型分布特征和抗病毒療效的研究，有助于預(yù)示病毒未來的變異和發(fā)展方向，為制定更加有效的防控措施提供指導(dǎo)。

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