張 科，劉彧崟，張 春，張德太

(1.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，湖北武漢430022;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢430022)

中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是相對分子質(zhì)量為25 000的糖蛋白，是運輸小的疏水性配體的脂質(zhì)運載蛋白家族成員，主要作用是參與抗菌和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。NGAL相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定并可分泌，故被認為是許多疾病，如急性腎損傷[1]、腫瘤[2]診斷和預(yù)后的生物學(xué)指標。

新近研究顯示NGAL可能與慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)，如 IgA 腎病、狼瘡性腎病、慢性腎小球腎炎以及糖尿病腎病[3-7]等的病理、生理過程相關(guān)。MORI等[8]研究表明NGAL能反映CKD實時腎損傷的程度。另有學(xué)者證實鼠同源NGAL(lipocalin 2，Lcn2)隨著腎功能的降低，其在近端小管有高表達，表達水平與腎小管損傷程度密切相關(guān)，尿Lcn2分泌量與腎組織Lcn2的表達水平呈正相關(guān)，因而認為Lcn 2可能是腎小球受損后腎小管及間質(zhì)細胞病理性增殖的特定啟動因子[9-11]。目前，國內(nèi)NGAL與CKD腎小管損傷的臨床研究少有報道。為此，我們研究了兩者之間的相關(guān)性，旨在探討NGAL是否可以作為CKD腎小管間質(zhì)損傷嚴重程度的標志物。

材料和方法

一、研究對象

選取2012年12月至2013年3月華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺的CKD住院患者124例，其中慢性腎小球腎炎29例、腎盂腎炎10例、紫癜性腎炎4例、IgA腎病11例、隱匿性腎炎6例、狼瘡性腎炎11例、原發(fā)性腎病綜合征20例、糖尿病腎病9例、間質(zhì)性腎炎24例，所有患者要求血壓控制良好，并能排除慢性腎炎急性發(fā)作、急性腎損傷、敗血癥及腫瘤等，收集腎穿刺患者腎穿刺前一天晨尿和靜脈血。選取2013年3月健康體檢者30名作為正常對照組，其中男16例，女14例，年齡25～72歲，腎功能和尿常規(guī)結(jié)果均正常，泌尿系統(tǒng)影像學(xué)檢查無異常，無肝、腎疾病及糖尿病等，同時收集晨尿和靜脈血。

二、儀器與試劑

NGAL和視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)試劑購自北京九強公司(批號分別為12-0530P 和 12-0808)，β2-微 球 蛋 白 (beta2-microglobulin，β2-MG)和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatin C，Cys C)試劑購自北京利德曼公司(批號分別為211022J和211124K)，測定儀器為日本OLYMPUS AU5421全自動生化分析儀。尿液分析使用迪瑞H-800尿液干化學(xué)分析儀及配套試劑。

三、方法

1.NGAL、RBP、Cys C 和 β2-MG 測定NGAL測定采用膠乳增強免疫透射比濁法，RBP、Cys C和β2-MG測定采用免疫比濁法。

2.腎臟病理活檢 CKD患者行常規(guī)腎穿刺取活檢組織，制片后分別行蘇木精-伊紅、六胺銀和馬松三色染色。依據(jù)Banff病理學(xué)分類分級系統(tǒng)腎小管間質(zhì)半定量進行評分，無腎小管間質(zhì)病變?yōu)?分、病變范圍 0%～5%為1分、病變范圍 6%～25%為2分、病變范圍25%～50%為3分、病變范圍＞50%為4分。依據(jù)腎小管間質(zhì)損傷程度將CKD患者分為輕度損傷、輕-中度損傷、中度損傷、中-重度損傷和重度損傷。由于重度損傷的患者一般情況較差，或者有禁忌癥，故臨床重度損傷腎穿刺很少，因此一般只分為輕度損傷、輕-中度損傷、中度損傷及中-重度損傷 4 組[12]。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析。尿NGAL呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)(M)[四分位間距(inter-quartile range，IQR)]來描述，組間比較采用非參數(shù)兩獨立樣本Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CKD各組和正常對照組一般臨床資料比較

CKD各組和正常對照組性別構(gòu)成、年齡和體重指數(shù)(body mass index，BMI)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 CKD各組和正常對照組一般臨床資料比較

二、CKD各組和正常對照組尿NGAL水平比較及尿NGAL與腎小管間質(zhì)損傷的相關(guān)性分析

CKD各組尿NGAL均明顯高于正常對照組(P均=0.000)，隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的加重，尿NGAL水平逐漸升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05)。見表2。

Spearman等級相關(guān)分析顯示尿NGAL水平與腎小管間質(zhì)損傷程度呈正相關(guān)(r=0.762，P ＜0.01)。

表2 CKD各組和正常對照組尿NGAL水平比較

三、尿NGAL與RBP、β2-MG和Cys C的相關(guān)性分析

尿NGAL與尿RBP、尿β2-MG、血清Cys C呈正相關(guān)[r=0.784、0.692、0.759，P 均 ＜0.01]，回歸方程分別為 Y=28.865X+59.607、Y=70.502X+48.69、Y=91.464X+2.391 1。見圖1 ～3。

圖1 尿NGAL與尿RBP的相關(guān)性分析

圖2 尿NGAL與尿β2-MG的相關(guān)性分析

圖3 尿NGAL與血清Cys C的相關(guān)性分析

四、尿NGAL診斷CKD腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線分析

尿NGAL、尿RBP、血清Cys C和尿β2-MG診斷CKD腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線見圖4。尿NGAL的ROC曲線下面積為0.855，最佳臨界點為45.35 ng/mL，敏感性為 77.2%，特異性為84.6%。尿RBP、血清 Cys C和尿 β2-MG 的 ROC曲線下面積分別為 0.803、0.776 和 0.748。尿RBP和尿 β2-MG最佳臨界點分別為0.35和0.55 mg/L 時，敏感性分別為 88.0%和 64.4%，特異性分別為66.7%和75.0%。

圖4 尿NGAL、尿RBP、血清 Cys C和尿β2-MG診斷CKD腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線

討 論

CKD種類繁多，臨床表現(xiàn)與腎臟的組織學(xué)改變并不完全一致，其治療方案及病情也差別極大，臨床確診主要依賴于腎穿刺。腎穿刺是一種有創(chuàng)檢查，技術(shù)要求高且存在各種禁忌癥，一般只有大型醫(yī)院才能開展該項檢查。因此，尋找可以替代腎穿刺且能反映腎小管間質(zhì)損傷的診斷指標意義重大。NGAL以往主要作為急性腎損傷的指標。然而，最近的研究顯示NGAL與CKD的病理、生理過程有關(guān)。因此，本研究擬通過尿NGAL來反映CKD病程中腎小管間質(zhì)損傷的程度，揭示尿NGAL與腎小管間質(zhì)損傷的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示不同腎小管間質(zhì)損傷程度的CKD患者尿NGAL水平均明顯高于正常人群(P均=0.000)，并且隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的增加，尿NGAL水平逐漸上升。通過腎組織病理學(xué)確認的腎小管間質(zhì)損傷程度與尿NGAL水平具有很好的相關(guān)性(r=0.762，P ＜0.01)。進一步分析顯示CKD患者尿NGAL水平與反映腎小管功能的經(jīng)典指標——尿RBP、β2-MG以及反映腎小球濾過率的敏感指標——Cys C均呈明顯正相關(guān)(r=0.784、0.692、0.759，P 均 ＜0.01)。因此，尿NGAL除了能反映CKD患者腎小管間質(zhì)損傷的程度外，在一定程度上還反映了CKD總體腎功能的情況。Cys C和NGAL的聯(lián)合檢測有助于CKD的早期診斷。這一觀點與 VIAU等[10]和BOLIGNANO 等[9，13]的研究結(jié)論一致。本研究結(jié)果顯示尿NGAL診斷CKD腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線下面積為0.855，最佳臨界值為45.35 ng/mL，敏感性為77.2%，特異性為84.6%。

NGAL參與了CKD的病理、生理過程，主要由腎小管上皮細胞產(chǎn)生而升高。NGAL是一種早期的腎臟損傷標志物，在腎小管間質(zhì)輕度損傷的時候就已經(jīng)升高。而腎小管功能的傳統(tǒng)標志物——RBP和β2-MG是在腎小管損傷、吸收功能減少后才升高，且β2-MG穩(wěn)定性不高，測定時對技術(shù)要求較高[14]。因此，NGAL相對于 RBP和β2-MG而言具有較高的診斷特異性，但必須注意的是尿NGAL會受到一些腫瘤、急性腎損傷以及慢性腎炎急性發(fā)作的影響。因此，在運用NGAL來評價CKD患者的時候，要排除上述疾病的影響。

[1]張雅麗，崔麗艷，張捷.中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白在急性腎損傷中的保護作用[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2015，30(1):80-84.

[2]須靜，胡曉波.中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白的研究進展[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27(10):871-876.

[3]BOLIGNANO D，DONATO V，COPPOLINO G，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)as a marker of kidney damage[J].Am J Kidney Dis，2008，52(3):595-605.

[4]YANG YH，HE XJ，CHEN SR，et al.Changes of serum and urine neutrophilgelatinase-associated lipocalin in type-2 diabetic patients with nephropathy:one year observational follow-up study[J].Endocrine，2009，36(1):45-51.

[5]LANE BR.Molecular markers of kidney injury[J].Urol Oncol，2013，31(5):682-685.

[6]LACQUANITI A，DONATO V，PINTAUDI B，et al."Normoalbuminuric"diabetic nephropathy:tubular damage and ngal[J].Acta Diabetol，2013，50(6):935-942.

[7]BHAVSAR NA，K?TTGEN A，CORESH J，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and kidney injury molecule 1(KIM-1)as predictors of incident CKD stage 3:the atherosclerosis risk in communities(ARIC)study[J].Am J Kidney Dis，2012，60(2):233-240.

[8]MORI K，NAKAO K.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as the real-time indicator of active kidney damage[J].Kidney Int，2007，71(10):967-970.

[9]BOLIGNANO D，LACQUANITI A，COPPOLINO G，et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and progression of chronic kidney disease[J].Clin J Am Soc Nephrol，2009，4(2):337-344.

[10]VIAU A，EL KK，LAOUARI D，et al.Lipocalin 2 is essential for chronic kidney disease progression in mice and humans[J].J Clin Invest，2010，120(11):4065-4076.

[11]KUWABARA T，MORI K，MUKOYAMA M，et al.Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin levels reflect damage to glomeruli，proximal tubules，and distal nephrons[J].Kidney Int，2009，75(3):285-294.

[12]IKEZUMI Y，SUZUKI T，HAYAFUJI S，et al.The sialoadhesin(CD169)expressing amacrophage subset in human proliferative glomerulonephritis[J].Nephrol Dial Transplant，2005，20(12):2704-2713.

[13]BOLIGNANO D，LACQUANITI A，COPPOLINO G，etal.Neutrophilgelatinase-associated lipocalin reflects the severity of renal impairment in subjects affected by chronic kidney disease[J].Kidney Blood Press Res，2008，31(4):255-258.

[14]劉連紅，馬艷華，羅建祥.高血壓病早期腎損傷患者尿視黃醇結(jié)合蛋白檢測的臨床意義[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(7):1177-1178.