周 慧，曾品濤(山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，太原 03000;揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司;通訊作者，E-mail:zhouhui_984@6．com)

洛伐他汀(lovastatin)是目前臨床上重要的降血脂藥物，對原發(fā)性高膽固醇血癥十分有效，是由真菌產(chǎn)生的一種甲基羥二戊酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能通過抑制HMG-CoA還原酶，減少膽固醇的合成，并上調(diào)肝細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體的表達(dá)，加速血液中低密度脂蛋白膽固醇向肝臟的轉(zhuǎn)移與代謝清除，從而達(dá)到降低血脂的功效［1］。洛伐他汀的提取一般采用溶媒萃取法［2-4］，但此法耗用大量溶媒，成本較高，經(jīng)多次轉(zhuǎn)提，收率較低。作者采用超臨界CO2流體對洛伐他汀進(jìn)行提取，探討超臨界CO2萃取的最佳條件及工業(yè)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

TC-SPE-50-0．5-210S 型0．5 L 超臨界萃取儀(沈陽天誠超臨界萃取有限公司);Ultrospec 4300TM紫外分光光度計(美國GE He2althcare);Waters高效液相色譜儀(Waters1525二元泵，Waters2487紫外檢測器);Breeze液相色譜工作站。菌渣(重慶大新藥業(yè)股份有限公司);洛伐他汀(上海信然生物技術(shù)有限公司，HPLC歸一化法測定含量為99．8%);CO2食品級(99．5%，重慶朝陽氣體廠);其他試劑均為市售分析純。

1．2 提取方法及實(shí)驗設(shè)計

稱取100．0 g經(jīng)干燥的紅曲霉發(fā)酵液菌渣9份，置超臨界萃取釜中，加入適量夾帶劑，按程序升溫加壓，進(jìn)行動態(tài)萃取，CO2流量為4．6 L/h，解析壓力為7 MPa，定量泵入夾帶劑。萃取結(jié)束后從解析釜收集產(chǎn)品，減壓回收乙醇，得到洛伐他汀粗品［5］。

本研究通過單因素實(shí)驗，考察了萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、夾帶劑用量(C)、萃取時間(D)對洛伐他汀萃取率的影響;通過正交實(shí)驗(因素水平見表1)優(yōu)化超臨界提取洛伐他汀的最佳工藝條件，并比較了各因素對萃取效果的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels

1．3 洛伐他汀產(chǎn)品檢測

用Waters高效液相色譜繪制洛伐他汀標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為 0．248-1．24 μg，色譜條件為:Shimadzu C18(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相為乙腈 -0．2%H3PO4溶液(60∶40);流速為 1．0 ml/min;檢測波長238 nm;柱溫為室溫。標(biāo)線方程為:Y=0．800 ×106X+2．657 6 ×105(r=0．999 7)［6-8］。

準(zhǔn)確稱取80．3 mg洛伐他汀粗品，用甲醇溶解定容至50 ml，0．45 μm 濾膜過濾，用高效液相色譜進(jìn)行檢測，計算產(chǎn)品純度，并將產(chǎn)品質(zhì)量換算為純的洛伐他汀質(zhì)量計算萃取率。

2 結(jié)果

2．1 單因素實(shí)驗

萃取壓力通常是影響萃取率的一個重要因素［9，10］，作者通過單因素實(shí)驗測定壓力對萃取率的影響，選用95%乙醇做夾帶劑，萃取溫度55℃，分別在 15，20，25，35，40 MPa 下進(jìn)行萃取 100 min，結(jié)果見圖1，可以看出超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳壓力為25 MPa。

圖1 萃取壓力對洛伐他汀萃取率的影響Figure 1 Effect of extraction pressure on the extraction rate

作者同樣采用單因素試驗考察萃取溫度［9，10］對洛伐他汀萃取率的影響，選用95%乙醇做夾帶劑，萃取壓力25 MPa進(jìn)行萃取100 min，，萃取溫度分別為40，45，50，55，60，65 ℃時的萃取率，結(jié)果見圖 2，可以看出最佳溫度為55℃。

圖2 萃取溫度對洛伐他汀萃取率的影響Figure 2 Effect of extraction temperature on the extraction rate

作者考察了95%乙醇做夾帶劑，萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃條件下，萃取時間分別為60，80，100，120，140 min 時洛伐他汀的萃取率。從圖3可以看出，100 min以后萃取率基本不增長，故選擇萃取100 min。

考慮到藥品原料“綠色環(huán)?！毙枨?，本研究選用95%乙醇作夾帶劑，用量分別為菌渣的500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 ml/kg。其他因素條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃，萃取100 min。實(shí)驗結(jié)果見圖4。從結(jié)果看出，夾帶劑用量低于2 000 ml/kg時，隨著夾帶劑用量的增大，萃取率升高;當(dāng)夾帶劑用量超過2 000 ml/kg萃取率開始下降，所以我們選擇夾帶劑用量為2 000 ml/kg。

圖3 萃取時間對洛伐他汀萃取率的影響Figure 3 Effect of extraction time on the extraction rate

圖4 夾帶劑用量對洛伐他汀萃取率的影響Figure 4 Effect of entrainer level on the extraction rate

2．2 正交試驗

根據(jù)文獻(xiàn)［11，12］方法及單因素試驗結(jié)果，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗，試驗結(jié)果見表2。分析得到超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳工藝條件為A2B3C2D2，由于在正交實(shí)驗中沒有包含此工藝條件，故對其進(jìn)行驗證實(shí)驗(見表3)，并同正交實(shí)驗中表現(xiàn)最佳的“實(shí)驗6”結(jié)果進(jìn)行比較。本工藝條件下洛伐他汀萃取率可高達(dá)97．17%，高于“實(shí)驗6”的萃取率95．53%。因此，超臨界CO2提取洛伐他汀的最佳工藝條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度55℃，夾帶劑用量為2 000 ml/kg，萃取時間100 min。

用極差分析法對正交實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析，由極差值可知，影響提取物中洛伐他汀含量的因素，逐次順序為:萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間＞夾帶劑用量。

用方差分析法對正交實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析(見表4)，根據(jù)F分布表判斷各因素對實(shí)驗效果影響的程度:萃取壓力(A)對提取物中洛伐他汀的含量有比較顯著影響，萃取溫度(B)、夾帶劑用量(C)、萃取時間(D)影響不顯著。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal test

表3 驗證試驗結(jié)果 (n=3)Table 3 The results of proof test (n=3)

表4 洛伐他汀含量方差分析Table 4 Variance analysis of the lovastatin content

3 討論

從影響洛伐他汀萃取率各因素的單因素試驗結(jié)果我們可以看出，萃取壓力增加，可以提高超臨界流體的溶解能力，提高提取物產(chǎn)量，但過高的萃取壓力卻會影響超臨界流體的溶解選擇性，導(dǎo)致更多的雜質(zhì)與目標(biāo)提取物競爭溶出，反而降低了目標(biāo)提取物的產(chǎn)量和純度，萃取壓力≥25 MPa時，洛伐他汀的萃取率反而下降;萃取過程中，隨著溫度的升高，洛伐他汀的溶解度增大，萃取率增加，當(dāng)溫度達(dá)55℃以上時，超臨界CO2流體的密度減小、溶解性能下降，萃取率下降;萃取過程隨著時間的延長，洛伐他汀的萃取率增加，當(dāng)萃取100 min以后萃取率基本保持不變，綜合考慮經(jīng)濟(jì)、節(jié)能等因素，我們選擇100 min為最佳提取時間;本研究選用95%乙醇作夾帶劑，夾帶劑用量少時，萃取率較低，可能是因為夾帶劑用量少，不能將洛伐他汀充分溶解其中;夾帶劑用量大時，溶解了其他成分，雜質(zhì)較多，萃取率降低，故我們選擇夾帶劑用量為2 000 ml/kg。

根據(jù)正交試驗結(jié)果以及驗證試驗的對比，我們確定超臨界CO2萃取洛伐他汀的最佳工藝條件為:萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，夾帶劑用量為2 000 ml/kg，萃取時間100 min，萃取率可達(dá)97．17%。各工藝參數(shù)對提取效果的影響排序為:萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間＞夾帶劑用量。

超臨界CO2萃取洛伐他汀萃取率高達(dá)97．17%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)溶媒提取法，CO2可重復(fù)使用，不存在有機(jī)溶劑殘留問題，無污染，具有環(huán)境友好、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)環(huán)境安全、成本低的優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求，有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。

［1］黃卓，李東棟．洛伐他汀最新研究進(jìn)展［J］．中國生化藥物雜志，2010，3l(2):144-147．

［2］韓文愛，李瑞珍．洛伐他汀工藝現(xiàn)狀及研究進(jìn)展［J］．石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2006，18(2):11-13．

［3］王健，劉剛?cè)宸ニ√崛」に囇芯浚跩］．河北化工，2006，29(5):21-22．

［4］馮建立，許振良，楊志和，等．洛伐他汀原料的質(zhì)量研究［J］．中國藥房，2007，18(3l):2450-2451．

［5］周慧，曾品濤，鄭一敏，等．洛伐他汀原料藥的萃取、純化工藝研究［J］．中國藥房，2013，23(9):816-818．

［6］陳麗艷，王和，霍金海，等．高效液相色譜法測定旨益膠囊中洛伐他汀的含量［J］．黑龍江醫(yī)藥，2009，22(6):765-766．

［7］謝靜，李東，王敏等．HPLC法測定血脂康膠囊中洛伐他汀的含量［J］．中國藥房，2010，21(45):4287-4289．

［8］李雪梅，薛嵐，符鵬，等．HPLC法測定血脂康膠囊中洛伐他汀和洛伐他汀酸的含量［J］．中國藥師，2012，15(2):164-166．

［9］李輝，倪晉仁，張歆，等．超臨界CO2提取黃姜中薯蕷皂甙元［J］．精細(xì)化工，2008，25(11):1079-1083．

［10］宋師花，賈曉斌，陳彥，等．超臨界CO2萃取靈芝子實(shí)體中的三萜類成分［J］．中國中藥雜，2008，33(17):2104-2107．

［11］李香荷，王曉良，吳一兵，等．歐亞旋覆花中1-O-乙酰基大花旋覆花內(nèi)酯的CO2超臨界正交優(yōu)化萃取工藝研究［J］．中藥材，2010，33(10):1636-1639．

［12］孔杰娜，謝茵，張凱，等．正交試驗優(yōu)化六神曲中淀粉酶和蛋白酶的提取工藝［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015，43(5):349-352．