孫 健，汪 云，陶建英，陳 瑛(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科，蘇州 500;南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院新生兒科;通訊作者，E-mail:cyandzh@sohu．com)

早產(chǎn)是指妊娠不足37周而分娩［1］，是一種常見、重要且復雜的妊娠并發(fā)癥，能顯著增加產(chǎn)褥期并發(fā)癥以及新生兒的各種疾病和病死率，約75%的圍產(chǎn)兒死亡與早產(chǎn)有關［2］。全世界每年約1 490萬早產(chǎn)兒降生，約占總新生兒的11．1%，而且比例有不斷上升的趨勢［3］。目前研究認為，早產(chǎn)是多種因素相互作用所致的一種綜合征，年齡、孕產(chǎn)史、不良行為、感染、遺傳因素、炎癥、宮縮和子宮頸長度等與早產(chǎn)相關［4，5］，但是早產(chǎn)發(fā)生的確切機制還不明確。隨著芯片技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)基因的異常表達是引起早產(chǎn)的重要原因。Chim等［6］的研究發(fā)現(xiàn)，孕晚期母親血清中基因的差異表達導致早產(chǎn)。而有關早產(chǎn)胎盤中基因表達譜的研究還很少，所以本研究應用基因芯片技術通過對早產(chǎn)的胎盤組織及足月產(chǎn)胎盤組織進行基因表達譜的檢測及qRT-PCR驗證，旨在篩選及確定與早產(chǎn)相關的基因，從而為早產(chǎn)的預防、診斷提供新的分子標志物。

1 材料與方法

1．1 材料來源與分組

選擇2013-02～2013-10在南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科常規(guī)產(chǎn)前檢查并且早產(chǎn)的早產(chǎn)兒16例為病例組，參照第7版《婦產(chǎn)科學》診斷標準，選取同期的健康足月產(chǎn)兒20例為對照組，獲取兩組胎盤組織作為研究材料。兩組均為單胎妊娠，年齡20-40歲的初產(chǎn)婦或經(jīng)產(chǎn)婦，排除原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病、心臟病、前置胎盤等內(nèi)外科疾病及產(chǎn)科并發(fā)癥，兩組孕婦詳細情況見表1。所有孕婦均已簽署知情同意書，方案通過南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 兩組孕婦及其新生兒一般情況比較Table 1 Comparison of general data of pregnant women and neonates between two groups

1．2 胎盤標本采集

標本采集于胎盤娩出后5 min內(nèi)迅速完成。于胎盤胎兒面，避開鈣化點，在胎盤不同區(qū)域剪取數(shù)塊胎盤組織，每塊約1 cm見方，經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的PBS漂洗2次，在濾紙上去除水分，分裝于凍存管內(nèi)，迅速置于液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存。

1．3 總RNA的提取

采用總RNA抽提試劑盒(QIAGEN’s RNeasy)，參照生產(chǎn)商的步驟提取胎盤組織總RNA。用分光光度計Nano Drop ND-1000測定RNA的濃度和純度，通過瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，RNA中無DNA、無蛋白質(zhì)污染、無明顯降解，可用于基因芯片檢測及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗。

1．4 基因芯片的雜交、清洗及掃描

病例組中隨機選取9例，對照組中隨機選取4例進行基因芯片分析，采用芯片為GeneChip Primeview Human Gene Expression Array(Affymetrix公司)。每例樣本取500 ng總RNA，使用IVT express kit(Affymetrix公司)擴增標記 cRNA，取15 μg標記好的cRNA，配制成 cocktail，加入芯片中于 Hybridization Oven 640(Affymetrix公司)中45℃雜交16 h，雜交好的芯片在FS450全自動洗滌工作站(Affymetrix公司)上洗滌染色，用GeneChip?scanner7G(Affymetrix公司)掃描芯片并通過AGCC軟件得到原始數(shù)據(jù)，原始數(shù)據(jù)導入Expression Console軟件(Affymetrix公司)得到質(zhì)控數(shù)據(jù)。

1．5 芯片數(shù)據(jù)分析

采用商業(yè)軟件Partek GS 6．5進行數(shù)據(jù)比對分析，去掉弱信號(信號值＜400)后，用各個樣本雜交信號值的中位值進行歸一化處理，篩選差異表達基因，采用國際上通用的基因功能分析法，即基因本體(gene ontology，GO)功能注釋分析法和KEGG通路分析法，對差異表達基因進行功能注釋與分析。

1．6 qRT-PCR 驗證

從芯片篩選到的差異表達的基因中，選擇可能具有一定臨床意義的基因在所有的樣本中進行qRT-PCR驗證(包括做基因芯片的樣本)。提取的每例樣本的總RNA通過HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit(Vazyme)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Vazyme)在 ABI 7500熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為內(nèi)參，采用相對定量法分析病例組及對照組胎盤組織中基因mRNA的表達，使用2-ΔΔCt法分析所選基因的相對表達水平。

1．7 統(tǒng)計學分析

芯片結(jié)果采用統(tǒng)計軟件SPSS 11．7進行分析，組間差異采用t檢驗(two-tailed)，其中2倍以上變化，P＜0．05認為差異具有統(tǒng)計學意義。qRT-PCR實驗每組樣品均設3個復孔，至少重復3遍。采用統(tǒng)計軟件SPSS 11．7進行分析。計量資料以±s表示，組間差異采用t檢驗(two-tailed)，P＜0．05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 基因芯片結(jié)果

基因芯片包含了條36 000個轉(zhuǎn)錄本的信息，根據(jù)該芯片的結(jié)果，將病例組和對照組的表達譜進行對比，其中2倍以上變化并且差異有統(tǒng)計學意義認為是差異表達的基因。符合條件的基因共有75個，其中表達上調(diào)的有9個，表達下調(diào)的有66個。PSG9是上調(diào)倍數(shù)最多的基因，而LEP則為下調(diào)倍數(shù)最多的基因(見表2)，聚類分類圖見圖1。

圖1 4例對照胎盤組織和9例病例組胎盤組織差異表達基因聚類分析圖Figure 1 Cluster analysis of 75 differentially expressed genes in placentas from 4 control placentas and 9 preterm placentas

表2 基因芯片檢測的人早產(chǎn)胎盤差異表達基因Table 2 Differentially expressed genes in placental tissues of the preterm neonates detected by microarray

2．2 GO功能注釋分析以及KEGG通路富集分析結(jié)果

對75個差異表達基因分別進行GO功能注釋分析以及KEGG通路分析。GO功能注釋分析結(jié)果:差異表達基因主要參與抗原加工提呈、免疫應答、傷害應答和系統(tǒng)進程的調(diào)節(jié)等信號途徑，篩選出的GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見表3。KEGG通路分析結(jié)果:將差異顯著基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進行查詢，設定P＜0．05為顯著性標準，差異表達基因中有全身性紅斑狼瘡相關、哮喘相關、同種異體移植物排斥相關、移植物抗宿主相關等信號通路相關作用的基因，篩選出的生物學通路名稱及其基因數(shù)見表4。

表3 差異表達基因的GO功能注釋結(jié)果Table 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

表4 差異表達基因的KEGG通路及其基因數(shù)Table 4 KEGG pathways and gene numbers of differentially expressed genes

2．3 qRT-PCR驗證差異表達基因的結(jié)果

選取芯片中表達有差異的4個基因:妊娠特異性β-1糖蛋白9(PSG9)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、人妊娠相關血漿蛋白2(PAPPA2)和抑制素β-A(INHBA)，以磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)為對照基因，應用qRT-PCR技術在16例病例組胎盤和20例對照組胎盤中進行驗證。結(jié)果表明，PSG9基因在病例組胎盤組織中的表達水平顯著高于對照組，與對照組相比表達上調(diào)1．82倍;而CRH、PAPPA2和INHBA基因在病例組中的表達水平低于對照組，與對照組相比分別表達下調(diào)3．28倍、2．98倍和2．19倍，其結(jié)果與基因芯片技術檢測結(jié)果基本相符(見表5)。

表5 差異表達基因的qRT-PCR驗證結(jié)果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

表5 差異表達基因的qRT-PCR驗證結(jié)果(±s)Table 5 Confirmation of differentially expressed genes by RT-PCR(±s)

基因 相對表達量對照組(n=20) 病例組(n=16)變化倍數(shù)P PSG9 2．05 ±1．21 3．73 ±1．54 +1．82 ＜0．05 CRH 0．92 ±0．63 0．28 ±0．13 -3．28 ＜0．01 PAPPA2 1．03 ±0．32 0．35 ±0．16 -2．98 ＜0．05 INHBA 0．55 ±0．37 0．25 ±0．14 -2．19 ＜0．05

3 討論

早產(chǎn)所致的圍生兒發(fā)病率、病死率以及后遺癥問題已成為一個世界性的衛(wèi)生問題，然而早產(chǎn)的病因、發(fā)病機制尚不明確，可能通過遺傳和環(huán)境的相互作用而發(fā)病，臨床上尚缺乏有效的對因防治措施［7］，因此找到早產(chǎn)的致病基因，從基因水平上預防治療早產(chǎn)十分重要?；蛐酒瑱z測技術是鑒定疾病相關基因的有力工具［8］，在產(chǎn)科相關疾病中有著廣泛的應用［9，10］。本研究通過基因芯片技術從早產(chǎn)胎盤中鑒定出75個差異表達的基因，并對芯片中有顯著差異表達的4個基因(PSG9、CRH、PAPPA2和INHBA)擴大樣本量進行了qRT-PCR檢測，其結(jié)果與基因芯片技術檢測結(jié)果基本相符。

PSG9是妊娠特異性糖蛋白(PSG)家族中的一員，在GO功能注釋中參與防御應答，PSG是在人類懷孕期間母體血液中含量最豐富的滋養(yǎng)層蛋白質(zhì)。有文獻表明低PSGs血清濃度與生長受限有關系［11］，部分文獻報道異常低濃度的PSGs與先兆子癇有關，但是也有研究表明異常低濃度的PSGs與先兆子癇沒有關系［11，12］，另外宮內(nèi)孕和宮外孕PSGs的表達差異可以作為宮外孕臨床檢測的標記物［13］。但是PSG9與早產(chǎn)的關系還鮮有報道，我們的結(jié)果表明PSG9在早產(chǎn)胎盤樣本中表達上調(diào)，提示可能改變機體的防御應答功能，從而早產(chǎn)中可能發(fā)揮重要作用，有望成為早產(chǎn)預測的一個分子標記物。

CRH在GO功能注釋中參與激素分泌的調(diào)節(jié)、防御應答和炎癥應答。在子宮、胎盤和卵巢中高表達，被認為參與妊娠的蛻膜化，胚胎植入和正常的懷孕過程以及分娩的開始［14］。胎盤源的CRH循環(huán)水平在孕期接近分娩時呈指數(shù)級增加，顯示CRH可能是孕期長短的影響因素。與Mayor-Lynn等［15］的報道不一致，他們在5名早產(chǎn)胎盤和5名足月產(chǎn)胎盤中進行qRT-PCR驗證得出相對于足月產(chǎn)胎盤，CRH在早產(chǎn)胎盤中過度表達。不一致的原因可能與個體差異和樣本量有關，他們一共10例，我們36例。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRH在早產(chǎn)胎盤中表達下調(diào)，可能改變了機體的激素分泌的調(diào)節(jié)、防御應答或炎癥應答功能，提示CRH在胎盤中表達下調(diào)可能與早產(chǎn)的發(fā)生有關。

PAPPA2在GO功能注釋中參與生長的調(diào)節(jié)。在人類胎盤中高表達，通過水解活性裂解胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)，PAPPA2裂解IGFBP5和可能裂解IGFBP3，因此調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子的釋放，以促進胎兒胎盤的生長。有研究表明，PAPPA2在胎盤中的異常表達可能與孕期并發(fā)癥有關，PAPPA2蛋白在孕婦的外周血中可以檢測到，因此可以用來作為胎盤異常的標記物［16］。我們的研究結(jié)果表明PAPPA2基因在早產(chǎn)胎盤中低表達，可能抑制胎盤的生長，從而在早產(chǎn)中起作用，有望成為早產(chǎn)預測的一個分子標記物。

INHBA在GO功能注釋中參與生長的調(diào)節(jié)、防御反應和激素分泌的調(diào)節(jié)。與α亞單位一起由二硫鍵結(jié)合而成抑制素A，抑制素A是一種異源二聚體糖蛋白，絕大多數(shù)學者認妊娠早期胎盤是抑制素A的主要來源，影響著妊娠的發(fā)生、發(fā)展及胎兒的生長發(fā)育。研究表明胎盤中INHBA的表達與生長受限有相關性，并且在子癇前期患者的胎盤中差異表達［17］;Zahra 等［18］的研究表明，母親孕中期血清中抑制素A的升高容易引起早產(chǎn)，可以作為預測早產(chǎn)的標記物。我們的研究結(jié)果表明INHBA基因在早產(chǎn)胎盤中低表達，而在早產(chǎn)中的功能還需要進一步的功能研究。

本研究存在著一些不足之處。首先，本研究例數(shù)較少，雖然基因芯片檢測結(jié)果與許多文獻報道相符，但還需要更大樣本重復上述實驗，以更準確地了解早產(chǎn)胎盤的基因表達譜。其次，本研究僅篩選并驗證了早產(chǎn)的差異基因，但相關差異表達基因在早產(chǎn)中所起的作用還需要功能試驗闡明。

綜上所述，本研究采用基因表達譜芯片技術檢測到早產(chǎn)胎盤組織中存在異常表達的基因譜和信號通路，并用qRT-PCR技術驗證了部分差異表達基因，與基因芯片檢測的結(jié)果一致，這些結(jié)果為早產(chǎn)的后續(xù)研究提供了新的思路。

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