嚴琦敏，張排旗，趙 波，張新宇，付學鋒(解放軍第醫(yī)院普通外科，西安 70054;第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院消化內科;蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經內科;共同第作者;通訊作者，E-mail:lkyyfxf@6．com)

顱腦損傷發(fā)病率的急劇上升已成為發(fā)展中國家醫(yī)學關注重點。WHO分析認為，作為神經外科常見急重癥的創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)在不久將可能位居全球疾病第3位，而交通事故則是最主要的致病原因［1-3］。TBI的輕型損傷是腦震蕩(cerebral concussion)，其發(fā)生率很高且機制不明［2-4］。TBI患者繼發(fā)性腦損傷所致的病理生理改變決定疾病的轉歸和預后，與繼發(fā)性腦損傷相關的因素有鈣超載、炎癥反應、缺血缺氧、興奮性氨基酸和某些自由基等［1］。

在哺乳動物大腦的免疫反應和炎癥活動中，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)發(fā)揮著重要作用，它作為腦內重要的細胞因子，也是機體炎癥或組織損傷的介質。TNF-α在激活神經膠質細胞和促進膠質細胞增生，以及組織的瘢痕形成等炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1，4］。我們通過實驗方法，在建立大鼠單純性腦震蕩(pure cerebral concussion，PCC)模型后應用免疫組織化學方法檢測損傷后不同時間點TNF-α在大腦前額葉皮質、顳葉皮質和梨狀皮質的表達變化，從而探討TNF-α與腦損傷病理生理變化的關系。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

過氧化物酶阻斷劑和非免疫羊血清為北京中衫金橋公司廠品;多克隆兔抗TNF-α抗體為上海橋星貿易有限公司提供;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG為北京康為世紀生物科技有限公司提供;圖文分析系統(tǒng)Image-Pro Plus6．0軟件為美國 Media Cybernetics公司提供;光學顯微鏡用Olympus BX51TPHD-J11型(日本)。

1．2 建立大鼠單純性腦震蕩(PCC)模型

健康雄性SD大鼠42只，體重(280．4±12．2)g(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)，實驗前適應性喂養(yǎng)2周。大鼠隨機分為正常對照組6只，損傷組36只。參照文獻［5，6］方法建立損傷組大鼠模型，于大鼠額頂部用“金屬單擺閉合腦損傷打擊裝置”進行鈍性一次性打擊，然后用類回歸方程分析腦震蕩昏迷和恢復過程相關指標和時間參數(shù)變化，將大鼠隨機分為1，12，24，48，72 h 和7 d 共6 個損傷組，每組6只。

1．3 標本采集與組織切片

用10%水合氯醛鈉(2．5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于冰袋上降低氧耗，然后用含多聚甲醛(4%)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7．2-7．4)腹腔灌注，取出腦組織再以含多聚甲醛(4%)的PBS固定液在4℃恒溫條件下固定48 h，將標本進行石蠟包埋，冠狀斷面進行連續(xù)切片(片厚為10-15 μm)，用于免疫組織化學。

1．4 免疫組織化學(SP法)檢測TNF-α

將腦組織石蠟切片脫蠟至水、抗原熱修復和PBS漂洗，加入內源性過氧化物酶阻斷劑(1∶150)室溫孵育10 min，PBS漂洗。滴加非免疫羊血清室溫封閉10 min。去除血清后直接滴加一抗為多克隆兔抗 TNF-α(1∶100)，4 ℃孵育24 h。室溫下 PBS 漂洗，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG(1∶50)，室溫孵育15 min。辣根酶標記鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液(1∶150)在室溫下孵育15 min，再以0．1%PBS triton 緩沖液(pH=7．4)漂洗，用 DAB 顯色3-10 min終止反應?？瞻讓φ沼?PBS(0．01 mol/L)替代一抗，操作步驟同上。

1．5 圖像采集分析

根據(jù)選定的部位(圖1)進行圖像采集。選取大鼠腦組織的前額葉皮質(PC)的一區(qū)(PC1)和二區(qū)(PC2)、顳葉皮質區(qū)(TC)和梨狀皮質區(qū)(Pir)進行檢測。圖文分析系統(tǒng)用Image-Pro Plus 6．0軟件，以TNF-α陽性棕色反應細胞作為分析區(qū)(area of interest，AOI)進行光密度值(optical density，OD)測定，每個部位連續(xù)選取5個高倍顯微鏡視野(×400)測出陽性反應物，最后計算出平均光密度值(AOD)，同時對同一時間點大鼠腦組織陽性細胞進行計數(shù)。

圖1 大鼠腦分區(qū)示意圖Figure 1 Brain areas diagram of rat

1．6 統(tǒng)計學分析

TNF-α陽性細胞AOD值和陽性細胞計數(shù)通過圖像確定，數(shù)據(jù)用±s表示。單因素方差分析(One-Way，ANOVA)用 SPSS 13．0 統(tǒng)計軟件，P ＜0．05即認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

在PC1、PC2、TC和Pir 4個腦分區(qū) TNF-α陽性表達和TNF-α陽性細胞變化基本相似，未見明顯差異，故用PC1和TC進行結果分析。

PCC大鼠腦組織細胞中TNF-α強弱和陽性細胞多少與著色相關，表達明顯染色越深，陽性細胞輪廓就越清晰可見，典型TNF-α陽性細胞輪廓清晰，細胞質呈棕褐色，細胞核不著色。PCC大鼠PC1(圖2A-G)和TC(圖2H-N)兩個腦區(qū)各時間點免疫組化染色表明，正常對照組 PC1(圖2A)和TC(圖2H)腦區(qū)有少量散在的TNF-α表達較弱的陽性細胞且輪廓不清晰。PCC大鼠PC1(圖2B-E)和TC(圖2I-L)腦區(qū)TNF-α陽性細胞染色和陽性細胞數(shù)均依時間延長(1，12，24，48 h)染色逐漸變深至棕褐色且細胞數(shù)量增多，72 h(圖2F，M)達到高峰，7 d(圖2G，N)陽性細胞染色減弱且數(shù)量減少，但仍未達到正常對照水平。與正常對照組比較，PCC大鼠不同時間點細胞 TNF-α表達(DOI)和陽性細胞數(shù)均有顯著差異(P ＜0．05，見圖3)。

圖2 PCC大鼠不同時間點PC1和TC區(qū)免疫組化染色TNF-α陽性細胞數(shù)Figure 2 The positive cells of TNF-α immunoreactivity expression in the cortex of PCC rats

圖3 PCC大鼠不同時間點PC1和TC區(qū)TNF-α陽性表達和陽性細胞數(shù)Figure 3 The immunoreactivity expression and number of TNF-α positive cell at different time points in PC1 and TC of the rats after PCC

3 討論

本實驗研究表明，TNF-α陽性表達和TNF-α陽性細胞變化在 PC1、PC2、TC和Pir腦分區(qū)基本相似，正常對照組大鼠前額葉皮質(PC)、顳葉皮質(TC)和梨狀皮質(Pir)腦區(qū)均可見少量散在的TNF-α弱陽性的表達。PCC大鼠TNF-α免疫陽性表達隨著造模時間推移逐漸增強，同時陽性細胞染色后輪廓變?yōu)榍逦?，且陽性細胞的計?shù)變化相同。72 h的PCC大鼠，TNF-α陽性表達和TNF-α陽性細胞數(shù)均達到峰值，并于7 d呈現(xiàn)下降趨勢，但仍未達到正常對照水平。我們研究提示，實驗性大鼠PCC損傷大腦PC區(qū)和TC區(qū)TNF-α表達出現(xiàn)明顯改變，表明TNF-α可能參與PCC所致傷損后的病理生理變化過程。

研究表明，腦震蕩早期缺血缺氧損傷的病理過程中有多種炎癥因子參與，包括TNF-α、白細胞介素和神經肽類等，而TNF-α含量變化與腦血流變化呈正相關［10-13］，TNF-α的表達水平可以間接表明腦組織損傷的程度［14-16］。監(jiān)測腦震蕩患者血清中TNF-α水平的變化可作為治療效果評定和預后分析的依據(jù)之一［17-19］。用自由落體撞擊裝置復制腦震蕩大鼠模型，通過免疫組織化學等方法研究認為，TNF-α表達陽性主要見于大腦皮質和海馬區(qū)的神經細胞胞質內，傷后即可出現(xiàn)表達并緩慢增強，數(shù)日內達到高峰，大多數(shù)于 1周出現(xiàn)下降，2周基本恢復正常［4-6］。本研究結果與既往報道相類似［17-19］，細胞中TNF-α表達和陽性細胞于3 d達高峰，7 d接近正常水平。多數(shù)研究表明［20-24］，大腦缺血缺氧性損傷后TNF-α均可呈現(xiàn)表達上調的反應，通過測定可以間接證實TNF-α參與了腦損傷發(fā)生早期病理過程的炎癥反應。研究腦損傷過程中TNF-α在表達時間上的報道有一定的差異，這種現(xiàn)象可能與研究的對象、動物模型構建和研究所采用的方法等因素相關［12-15］。TNF-α介導腦損傷炎癥反應的機制比較復雜，目前研究認為，其機制可能與下列因素有關:①外力因素致使大腦微循環(huán)功能障礙，出現(xiàn)血管通透性增高和血-腦屏障被破壞，形成腦水腫或腦水腫加重，TNF-α與腦損傷后病理改變互為因果［6］。②活化炎癥反應細胞，對血管內皮細胞表達的相關黏附分子-1(ICAM-1)、白介素(IL)發(fā)揮激活作用，同時加強白細胞與內皮細胞間黏附促使炎細胞向外浸潤血管［20-22］。③影響星形膠質細胞對神經生長因子的表達，促進腦膠質細胞增生和修復［1，22］。④具有抗炎和促炎雙向作用。外傷性腦血管功能紊亂或腦水腫時表現(xiàn)為抑制免疫反應，當病變恢復時則具有促進炎癥消退作用，這一過程可能通過腦損傷時細胞間信號轉導級聯(lián)反應來實現(xiàn)［20］。TNF-α作為炎性介質所發(fā)揮的功能效應受其濃度、作用時間和所針對受體，以及作用的時機等因素的影響［4，11-13］。

腦震蕩(cerebral concussion)是暫時性的中樞神經系統(tǒng)功能障礙，大多數(shù)是輕度暴力作用于頭部致使短暫性意識喪失和近事忘卻，屬于一過性神經功能改變而無器質性損害［1，22］。已有研究發(fā)現(xiàn)，受暴力直接作用部位的神經元線粒體可出現(xiàn)腫脹和神經軸突損傷，特別是反復或持久的腦震蕩患者，腦組織的軸突變性明顯，并伴代謝紊亂，這或許是引起后遺癥的重要因素［23-25］。在腦損傷中，PCC屬于最輕型，特別是作為聯(lián)合皮質重要部分的前額葉皮質受力后，大多數(shù)患者在學習、注意力和判斷力等方面都可能出現(xiàn)障礙［23-26］，因為受傷部位是學習記憶功能的關鍵部位［17］。研究認為，大鼠海馬、顳葉皮質和梨狀皮質是空間學習和記憶中樞，而梨狀皮質還與嗅覺和情緒等功能有關［22］。本實驗發(fā)現(xiàn)，PCC致傷后PC、TC和Pir腦區(qū)均有TNF-α表達增強的改變，已有研究證實這可能影響大鼠的學習和記憶等功能［1，24-26］。PCC 后 TNF-α 表達水平與大腦損傷程度和中樞神經系統(tǒng)的認知障礙密切相關，對大腦損傷患者檢測TNF-α表達水平是反應損害嚴重程度的一個側面［27-29］。

由于認知功能障礙與TNF-α之間存在一定的相關性，因此，本實驗從PCC模型大鼠的PC、TC和Pir腦區(qū)測定神經元TNF-α表達和陽性細胞數(shù)量角度進行分析，從而證實PCC與學習記憶存在一定的相關性［28-30］。我們推斷，顱腦損傷導致的 TNF-α上調對組織細胞損傷可能有明顯促進作用，臨床上通過人為方法抑制TNF-α表達可能有助于延緩或減輕損傷后的病理生理反應。進一步研究TNF-α在腦損傷病理過程中作用機制并找出抑制策略，這對減輕患者腦損傷后遺癥有一定指導作用［31］。

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