李世舉，王艷旭，吳松鷹，吳成翰，王謹(jǐn)敏(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院腦病科，福州 350003;福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腦病科;通訊作者，E-mail:4767086@qq．com)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)的一種自身免疫性疾病，病殘率高。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是國(guó)際公認(rèn)的 MS的動(dòng)物模型，可以用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)MS的治療作用，并探索其治療機(jī)制。NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是炎癥反應(yīng)的總開(kāi)關(guān)之一，與免疫細(xì)胞的增殖、活化和凋亡密切相關(guān)，在MS及EAE發(fā)病及病情發(fā)展中起關(guān)鍵作用［1］。白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)為白芍中提取的有效成分，具有多途徑抑制自身免疫反應(yīng)的藥理作用［2］。國(guó)內(nèi)目前已開(kāi)展TGP治療EAE 的研究［3，4］，并取得良好療效，但目前尚未見(jiàn)TGP對(duì)EAE外周免疫器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB p65影響的研究。本研究采用TGP預(yù)防性治療EAE大鼠，觀察TGP對(duì)EAE大鼠外周免疫器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB p65表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6-8周健康清潔雄性Lewis大鼠60只，體質(zhì)量150-180 g，動(dòng)物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。雌性豚鼠13只，體質(zhì)量450 g到500 g，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0011。

1．2 白芍總苷及主要試劑

白芍總苷膠囊，三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào):110904，以白芍總苷計(jì) 0．3 g/粒);NF-κB p65一抗(美國(guó)Santa Cruz公司);二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DAB顯色系統(tǒng)試劑盒、BCIP/NBT顯色液、核快紅復(fù)染液(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司);蘇木精、伊紅染色劑(北京經(jīng)科化學(xué)試劑經(jīng)營(yíng)公司);弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司，含滅活結(jié)核桿菌1 mg/ml);百日咳疫苗(Bordetella Pertussis Vaccine，BPV)由上海生物制品研究所提供;滅活牛型結(jié)核桿菌由上海生物制品研究所提供(1 ml約含100 mg)。

1．3 大鼠分組及EAE模型的建立

大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組(n=10)、模型組(n=25)、TGP組(n=25)。無(wú)菌條件下取豚鼠脊髓勻漿，先將與該勻漿液等體積的弗氏完全佐劑與滅活結(jié)核桿菌混合，使其成為含6 mg/ml的弗氏完全佐劑。在冰浴條件下使兩者充分研磨形成誘導(dǎo)乳劑。TGP組及模型組大鼠后肢足掌皮內(nèi)注射誘導(dǎo)乳劑，共0．4 ml/只。每只大鼠背部皮下注射0．1 ml BPV。對(duì)照組以等量PBS代替豚鼠脊髓勻漿，余同其他組。

1．4 藥物干預(yù)

按照藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物劑量換算公式，根據(jù)人類(lèi)TGP的常用劑量來(lái)?yè)Q算大鼠的劑量，采取0．2 g/(kg·d)的劑量。白芍總苷藥片溶于于生理鹽水溶液中制成懸濁液。TGP組的大鼠，從免疫第1天起(免疫當(dāng)天記為第1天)，每天經(jīng)口灌服白芍總苷懸濁液0．2 g/kg。對(duì)照組及模型組給予同體積生理鹽水。

1．5 臨床觀察

常規(guī)飼養(yǎng)三組大鼠，自免疫后第1天起，由同一人同一時(shí)間段單盲觀察發(fā)病情況，行臨床神經(jīng)功能評(píng)分。臨床神經(jīng)功能評(píng)分采用5分法［5］:0分，無(wú)任何體征;1分，尾部無(wú)力;2分，后肢無(wú)力;3分，雙后肢完全癱瘓;4分，前后肢癱瘓;5分，瀕死狀態(tài)或死亡。以大鼠達(dá)到或超過(guò)1分為臨床EAE發(fā)病。大鼠每日的平均臨床神經(jīng)功能評(píng)分，分別由當(dāng)日臨床積分總和除以該組大鼠的數(shù)目獲得。

1．6 組織切片的制備

大鼠在免疫后第14天，麻醉后經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水250 ml，繼以含4%多聚甲醛0．1 mol/L PBS液300 ml灌注后，取腦、脊髓、脾及淋巴結(jié)置于10%的甲醛中固定18 h。石蠟包埋，制4 μm厚切片。

1．7 病理學(xué)檢查

常規(guī)HE染色，每只動(dòng)物中樞神經(jīng)各取4張切片(大腦視交叉水平、腦干、頸膨大、腰膨大各隨機(jī)取1張切片)，光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)目，把各節(jié)段炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)相加作為該只大鼠的總的炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)。

1．8 免疫組化檢測(cè)NF-κB p65

采用二步法，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，NF-κB p65(1∶100)，以0．01 mol/L PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。具體步驟:石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，ddH2O沖洗，抗原微波修復(fù)，PBS沖洗，滴加3%過(guò)氧化氫室溫孵育15 min，PBS沖洗，滴加一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育15 min，PBS沖洗，DAB顯色，ddH2O及流水沖洗，蘇木素復(fù)染，ddH2O沖洗，0．5%鹽酸酒精分化，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯中透明，封片。每只動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)各取4張切片(大腦視交叉水平、腦干、頸膨大、腰膨大各隨機(jī)取1張切片)，脾及淋巴結(jié)隨機(jī)各取3張切片，光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取5個(gè)不重疊的高倍視野(×400)。胞質(zhì)及(或)胞核出現(xiàn)淺黃色-黃褐色者為NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞。

用數(shù)字顯微攝影系統(tǒng)拍照，用Image-Pro Plus 5．0圖像分析軟件，測(cè)定每個(gè)高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(integral optical desity，IOD)值。取均數(shù)作為該只大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾及淋巴結(jié)的NF-κB p65的IOD值。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20．0軟件處理。發(fā)病率用Fisher確切概率法檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(發(fā)病率兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)經(jīng)Bonferroni校正，以P＜0．012 5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。

2 結(jié)果

2．1 動(dòng)物臨床表現(xiàn)

對(duì)照組大鼠不發(fā)病，模型組發(fā)病率為100%，TGP組發(fā)病率96%。模型組和TGP組大鼠于免疫后8 d開(kāi)始發(fā)病，逐漸出現(xiàn)尾巴、后肢和前肢無(wú)力乃至癱瘓，食欲下降，毛發(fā)失去光澤，重者伴大小便失禁，免疫后第12天平均神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)到高峰。發(fā)病率三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。進(jìn)一步兩兩比較，模型組發(fā)病率與TGP組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．012 5)，模型組發(fā)病率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．012 5)，TGP組發(fā)病率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．012 5)。TGP組發(fā)病潛伏期比模型組長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。TGP組臨床神經(jīng)功能評(píng)分最高值比模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)表1)。

2．2 動(dòng)物病理學(xué)改變

發(fā)病的大鼠腦及脊髓可見(jiàn)多發(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從形態(tài)上看，炎性細(xì)胞多為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。部分小血管管周有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成“袖套”狀改變，還可以見(jiàn)到淋巴細(xì)胞結(jié)節(jié)形成。病灶多位于白質(zhì)，灰質(zhì)也出現(xiàn)少量上述病變，但程度較輕。TGP組炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞比模型組少，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。對(duì)照組大鼠腦及脊髓病理檢查未見(jiàn)異常(見(jiàn)表1、圖1)。

表1 大鼠臨床評(píng)估及病理改變Table 1 Clinical assessment and pathological changes in rats

圖1 三組大鼠脊髓病理改變(HE染色，×400)Figure 1 The pathological changes of spinal cord in three groups(HE，×400)

2．3 NF-κB p65 的表達(dá)

對(duì)照組腦及脊髓有極少量NF-κB p65蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布，從形態(tài)上判斷，為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞。模型組可見(jiàn)腦及脊髓大量的NF-κB p65蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布，以白質(zhì)區(qū)居多，從形態(tài)上判斷，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞均有NF-κB p65的表達(dá)，但以炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞特別是血管周?chē)装Y浸潤(rùn)細(xì)胞高表達(dá)NF-κB p65為主，部分NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)移，提示 NF-κB的活化，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。TGP組腦及脊髓NF-κB p65蛋白的表達(dá)較對(duì)照組高，但較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。三組大鼠淋巴結(jié)及脾均有NF-κB p65蛋白陽(yáng)性細(xì)胞。模型組脾及淋巴結(jié)NF-κB p65蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組及TGP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。TGP組脾及淋巴結(jié)NF-κB p65蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)表2，圖2-4)。

表2 大鼠外周免疫器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB p65蛋白的IODTable 2 The IOD of NF-κB p65 protein in the peripheral immune organs and CNS in rats

圖2 三組大鼠脊髓NF-κB p65的表達(dá)(DAB顯色，蘇木素復(fù)染，×400)Figure 2 The protein expression of NF-κB p65 in spinal cord in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

圖3 三組大鼠脾NF-κB p65的表達(dá)(DAB顯色，蘇木素復(fù)染，×400)Figure 3 The protein expression of NF-κB p65 protein in spleen in three groups(DAB coloration，hematoxylin re-staining，×400)

3 討論

MS的發(fā)病機(jī)制包括外周自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞(主要是T細(xì)胞)的活化增殖，血腦屏障的破壞，自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步破壞血腦屏障，進(jìn)一步募集抗原特異的淋巴細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促使其他炎癥細(xì)胞和效應(yīng)分子如巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［6，7］。脾及淋巴結(jié)是主要的外周免疫器官，外周免疫器官在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用［7，8］。目前認(rèn)為抗原特異的淋巴細(xì)胞激活后在外周免疫器官不斷增殖，然后不斷釋放入血液及淋巴循環(huán)中，是MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)活化的淋巴細(xì)胞的主要來(lái)源［7，8］。

NF-κB是最為重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，廣泛參與了多種基因的表達(dá)調(diào)控，其中包括多種與免疫反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子和黏附分子，是免疫反應(yīng)的總開(kāi)關(guān)之一。NF-κB引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在MS和EAE發(fā)病及病情進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。NF-κB能促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞分化，上調(diào)TNF-α、IL-1、IL-2、IFN-γ、GM-CSF 等炎性因子及 VCAM-1、ICAM-1等細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，加重EAE臨床癥狀［1］。NF-κB的表達(dá)及活化對(duì)外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化與增殖是必須的，選擇性NF-κB 抑制劑能減輕 EAE 病情［1］。NF-κB p65 亞基是NF-κB最重要的具有轉(zhuǎn)錄活性的亞基。

TGP在目前的臨床用藥劑量下具有多途徑抑制自身免疫反應(yīng)的藥理作用，對(duì)多種自身免疫性疾病的治療取得良好效果［2］。研究表明 TGP能抑制NF-κB 蛋白的表達(dá)與活化［2，9］，這對(duì) EAE 或 MS 的治療具有重要意義。徐曉婭等［4］的研究表明，TGP能降低EAE大鼠血清IFN-γ、TNF-α的水平，這可能是通過(guò)抑制NF-κB來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

在本實(shí)驗(yàn)中，TGP組與模型組比較，TGP組的發(fā)病潛伏期延長(zhǎng)(P＜0．05)，神經(jīng)功能評(píng)分降低(P＜0．05)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞減少(P＜0．05)，臨床與病理均表明該藥對(duì)EAE的確有治療作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)比對(duì)照組高(P ＜0．05)，說(shuō)明EAE大鼠淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)上調(diào)。NF-κB表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)T細(xì)胞向Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)淋巴結(jié)及脾自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步活化與增殖［1］，進(jìn)而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多，加重EAE的病情。TGP組淋巴結(jié)及脾 NF-κB p65的表達(dá)較模型組低(P＜0．05)，表明TGP能抑制 EAE大鼠的淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)，從而減輕自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步活化與增殖，有利于減輕EAE的病情。TGP組淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)較對(duì)照組高(P＜0．05)，說(shuō)明TGP尚不能完全抑制淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)，僅能部分抑制淋巴結(jié)及脾NF-κB p65的表達(dá)。對(duì)照組腦與脊髓NF-κB p65的表達(dá)極少，模型組腦與脊髓高表達(dá)NF-κB p65，主要位于血管周?chē)难装Y浸潤(rùn)細(xì)胞，部分NF-κB p65蛋白核轉(zhuǎn)移，提示NF-κB處于激活狀態(tài)，這與國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［1，10］一致。目前的研究［1］表明中樞神經(jīng)系統(tǒng) NF-κB的表達(dá)及活化能使EAE的病情加重。在本實(shí)驗(yàn)中，TGP組腦與脊髓 NF-κB p65的表達(dá)比模型組低(P＜0．05)，說(shuō)明TGP能抑制EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB p65的表達(dá)，從而減輕EAE的病情。綜上，我們推測(cè)TGP治療EAE的部分機(jī)制可能是通過(guò)抑制外周免疫器官NF-κB表達(dá)，從而減少外周免疫器官內(nèi)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化增殖，減少進(jìn)入淋巴系統(tǒng)及血循環(huán)中自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而減少自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的數(shù)量，減輕EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn);在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，TGP可抑制NF-κB的表達(dá)，從而抑制已活化的炎癥浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步增殖及淋巴細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)一步募集，減輕EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，并在轉(zhuǎn)錄水平減少炎性細(xì)胞因子及黏附分子的分泌，抑制了NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，切斷了其后的一系列炎癥脫髓鞘過(guò)程，進(jìn)而減輕了EAE的病情。

總之，TGP對(duì)EAE的治療是有效的，其機(jī)制之一可能是通過(guò)抑制外周免疫器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)NF-κB p65的表達(dá)，從而抑制外周免疫器官及中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化、增殖，抑制了NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕EAE的病情。當(dāng)然，TGP治療MS還只處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段，其治療機(jī)制有待進(jìn)一步研究。TGP作為一種成熟的中成藥，其副作用少，價(jià)格不高，相信隨著研究的深入，在MS的治療中應(yīng)該有較大的作為。

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