鄭 琪，徐玉喬，張 茜，趙凌宇，廖子君，南克俊(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安 7006;第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院病理科;西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室;西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

世界范圍內(nèi)胃癌的年發(fā)病人數(shù)在所有惡性腫瘤排第四位，年死亡人數(shù)排第二位［1］。全球胃癌的發(fā)病率和死亡率在過去幾十年中已經(jīng)出現(xiàn)了明顯下降［2］，但它仍然是威脅人類健康和生命最常見的惡性腫瘤之一。晚期轉(zhuǎn)移性胃癌患者的中位生存期僅僅8-10個(gè)月，其5年生存率不到7%［3］。研究胃癌相關(guān)基因，有助于深入了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，提高其診斷和治療水平。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解，在維持細(xì)胞的正常生長和失控增殖的平衡方面起著重要的作用。Cullin家族的泛素連接酶是其中最大的一類RING型E3泛素連接酶，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)，cullin活性的失調(diào)可能引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和癌變［5，6］。CAC1(CDK-associated cullin 1)是從結(jié)直腸癌中分離和鑒定出來的一個(gè)cullin家族新基因。它在人體多種正常組織中均有表達(dá)，在正常細(xì)胞中的表達(dá)水平低于腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平隨著惡性程度的增高而增高。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CAC1與細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的調(diào)控有關(guān)。而且，它可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)結(jié)合并提高其活性［7］。由于目前有關(guān)CAC1的研究結(jié)果主要來源于結(jié)直腸癌，因而對它在胃癌中的表達(dá)和生物學(xué)特性所知甚少。本研究選擇與結(jié)直腸癌組織學(xué)起源類似的胃癌作為研究對象，研究CAC1在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞系與組織標(biāo)本

人胃黏膜細(xì)胞系GES-1購自上海艾研生物科技有限公司;人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自中科院上海細(xì)胞庫;人胃癌細(xì)胞系MGC803、BGC823由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心保存。

組織標(biāo)本:選用35例胃腺癌組織(臨床分期為Ⅰ-Ⅳ期)及相應(yīng)正常組織(距癌組織邊緣大于10 cm的正常組織)標(biāo)本，來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，所有樣本臨床病理資料齊備，病理診斷明確。

1．2 試劑及溶液

10%新生小牛血清購自美國Gibico公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，胰蛋白酶購自中國寶信生物，Trizol購自美國Invitogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Invitogen公司，原位雜交專用蓋玻片，多聚賴氨酸(POLY-L-LYSINE)，焦碳酸二乙酯(DEPC)，敏感性加強(qiáng)型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB Kit(20×)購自北京鼎國生物工程有限公司。

1．3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測胃癌中CAC1的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng):常規(guī)貼壁法將人胃黏膜細(xì)胞系GES-1、人胃癌細(xì)胞系 AGS、MGC803、BGC823 培養(yǎng)于10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的細(xì)胞備用。

RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄:Trizol法提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RNA定量分析和RNA電泳，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃ 15 min;滅活逆轉(zhuǎn)錄酶:95℃ 2 min，經(jīng)過上述反應(yīng)得到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，可加入RT-PCR反應(yīng)體系。所得反應(yīng)液置于-20℃保存?zhèn)溆?分光光度計(jì)檢測A260/A280值，估計(jì)DNA的濃度。

實(shí)時(shí)定量PCR:依據(jù)CAC1的cDNA和管家基因β-actin的cDNA序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR寡核苷酸引物。序列通過BLAST進(jìn)行比對具有特異性。引物序列由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，具體如下。CAC1-forward:5＇-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3＇，CAC1-reverse:5＇-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3＇;β-actin forward:5＇-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3＇，β-actin reverse:5＇-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3＇。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，加樣如下，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)檢測管，各樣品混勻后，離心，上機(jī)檢測，熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)時(shí)獲取擴(kuò)增曲線;反應(yīng)過程:95℃預(yù)變性5 min→95℃變性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸40 s;總計(jì)40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀相應(yīng)軟件程序記錄、分析檢測數(shù)據(jù)，輸出結(jié)果。根據(jù)公式Folds=2-ΔΔCt計(jì)算各檢測目的基因的相對表達(dá)量，比較各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間目的基因擴(kuò)增的變化情況。

公 式:ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ctβ-actin)對照組。

1．4 原位雜交法檢測胃癌組織中CAC1的表達(dá)

探針的合成:CAC1基因的原位雜交探針序列，依據(jù)CAC1編碼框序列設(shè)計(jì)，全長為46 bp，由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)合成。探針序列:5＇-TTC ATT AAG AAC TTG GAG G(U)GGA GGT GTT GAT GTT GAT GGT GGA GC-3＇dig;3＇端地高辛標(biāo)記，中部2F-RNA修飾“(U)”中堿基。采用多聚賴氨酸對玻片進(jìn)行處理，癌組織和癌周圍正常組織石蠟塊各切片5張，每張切片厚度5 μm。

實(shí)驗(yàn)步驟:切片脫蠟、暴露核酸片段、預(yù)雜交、雜交、雜交后洗滌、滴加封閉液、滴加生物素化鼠抗地高辛、滴加SABC、滴加生物素過氧化物酶、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水封片，鏡檢。結(jié)果觀察:陽性細(xì)胞的胞質(zhì)著色呈棕黃色。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過整理后輸入SPSS19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果使用±s的形式，單向方差分析法(One-way ANOVA)比較不同組間均數(shù)的差異，P＜0．05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;原位雜交實(shí)驗(yàn)的臨床資料和結(jié)果，使用四格表卡方檢驗(yàn)法(Chi-square test four-fold table)，P ＜0．05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 CAC1在胃黏膜和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測了不同胃癌細(xì)胞系和胃黏膜細(xì)胞系中CAC1 mRNA表達(dá)量，獲取目的基因擴(kuò)增曲線(圖 1A)，按照公式:Folds=2-ΔΔCt計(jì)算?；虻娜芙馇€可反映擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，如曲線為單峰且峰值高，則表示擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性的靶片段。本研究結(jié)果中的溶解曲線均為單峰(圖1B、C)，表明獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。

結(jié)果顯示，無論在胃癌細(xì)胞系還是在胃黏膜細(xì)胞系中，均可以檢測出CAC1 mRNA的表達(dá)，但其表達(dá)水平有所不同(見圖2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，胃癌細(xì)胞系中，AGS或MGC803細(xì)胞系的CAC1 mRNA表達(dá)水平均高于 BGC823細(xì)胞系(1．000 0±0．000 0 or 0．950 7 ±0．017 6 vs 0．434 0 ±0．041 4，P ＜0．05)，但AGS與MGC803之間CAC1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P＞0．05)。另一方面，上述胃癌細(xì)胞系(AGS or MGC803 or BGC823)的CAC1 mRNA水平都顯著高于胃黏膜細(xì)胞系 GES-1(0．201 7 ±0．008 2，P ＜0．05)。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR的CAC1的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Figure 1 Amplification and melt curves of CAC1 by real-time PCR

圖2 各細(xì)胞系中CAC1-mRNA的表達(dá)水平Figure 2 CAC1 mRNA expression in different cell lines

2．2 CAC1在胃癌組織和癌周正常組織中的表達(dá)

原位雜交結(jié)果顯示，CAC1在胃癌組織中表達(dá)水平較高，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，在癌周正常組織中表達(dá)水平很低，僅在間質(zhì)中存在少量非特異性表達(dá)(見圖3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示，CAC1在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于胃癌周圍正常組織，兩者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CAC1在癌組織中的陽性表達(dá)率與患者年齡、細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與胃癌的臨床分期有關(guān)，分期越晚，陽性率越高(見表1)。

圖3 CAC1在胃癌組織和胃正常組織中的表達(dá)(ISH，×400)Figure 3 CAC1 expression in gastric cancer and normal tissues(ISH，×400)

表1 CAC1在胃癌組織和胃周圍正常組織中的表達(dá)Table 1 CAC1 expression in gastric cancer and surrounding normal tissues by in situ hybridization

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道［7］，對人組織的cDNA文庫進(jìn)行RTPCR法檢測，CAC1在結(jié)腸、小腸、肝臟、胃、肺、腎、肌肉、心臟、乳腺、腦、脾臟、淋巴結(jié)等多種組織中均有不同程度的表達(dá)，其中結(jié)腸和乳腺組織中的表達(dá)水平較高，而在胃組織中僅有微弱的表達(dá);Western blot法發(fā)現(xiàn)CAC1在多個(gè)正常細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，而且CAC1在正常細(xì)胞系中的表達(dá)水平低于腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著惡性程度的增高而增高［7］。

本研究經(jīng)過實(shí)時(shí)定量PCR法檢測后發(fā)現(xiàn)，CAC1的mRNA在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和MGC803中的表達(dá)水平較高，在BGC823細(xì)胞系中表達(dá)水平相對較低。值得注意的是，3個(gè)胃癌細(xì)胞系中CAC1的mRNA表達(dá)水平均明顯高于胃黏膜細(xì)胞系GES-1。由此我們推測，CAC1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平高于胃正常細(xì)胞，可能在胃癌的形成過程中發(fā)揮一定作用。

有趣的是，胃癌細(xì)胞不同的P53狀態(tài)可能對CAC1表達(dá)無明顯影響。本研究所涉及的三個(gè)胃癌細(xì)胞系中，AGS為P53野生型，MGC803和BGC823均為P53突變型。雖然 AGS和 MGC803細(xì)胞的CAC1水平高于BGC823，但前兩者之間的CAC1表達(dá)水平無明顯差異。

此前的研究中檢測了66例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的遠(yuǎn)端正常結(jié)直腸組織中CAC1的表達(dá)情況:CAC1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，在間質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá);正常結(jié)直腸組織中CAC1主要表達(dá)于黏膜上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá);統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示，CAC1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的病理類型及臨床分期有關(guān)，與患者年齡、腫瘤部位及轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)［7］。

本研究采用原位雜交法，檢測了35例胃癌患者的癌組織及相應(yīng)的胃正常組織中CAC1的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CAC1在胃癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，在相應(yīng)的胃正常組織中表達(dá)水平較癌組織中顯著降低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):CAC1在胃癌組織中的表達(dá)高于胃正常組織;CAC1在胃癌組織中的陽性表達(dá)率與胃癌的臨床分期有關(guān)，隨著臨床分期的升高而增高，而與患者年齡、細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)。以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)直腸癌組織中CAC1表達(dá)特點(diǎn)非常相似。

原位雜交是本研究采用的主要技術(shù)之一，它雖與免疫組化技術(shù)有許多相似之處，但在組織切片的處理、探針制備、顯色方法等方面卻有其特殊之處。首先，組織的固定，應(yīng)盡可能保存組織中的靶核酸成分和原有的組織結(jié)構(gòu)。需要將內(nèi)源性核酸酶失活，避免其對靶核酸的降解，同時(shí)在原位雜交整個(gè)過程中避免外源性核酸酶的污染。其次，本實(shí)驗(yàn)選用人工合成的單鏈寡核苷酸探針，特異性較高，分子量小，與相同量的雙鏈DNA探針相比，具有更高的摩爾濃度;用地高辛標(biāo)記探針后，再用相應(yīng)的原位雜交檢測試劑盒檢測與靶分子結(jié)合后的地高辛標(biāo)記。再次，建立合適的雜交條件，注意雜交液及切片變性時(shí)的實(shí)際溫度能否達(dá)到所要求的溫度，變性后要馬上進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的DNA又會(huì)重新復(fù)性。最后，原位雜交結(jié)果的顯示應(yīng)體現(xiàn)特異性和敏感性。除探針的選擇應(yīng)通過鑒定外，必須在每一次試驗(yàn)中選擇陽性或陰性對照。陽性對照可選擇Northern/Southern印記雜交或用不同互補(bǔ)探針與靶核酸雜交。陰性對照可選擇雜交前用RNA酶或DNA酶消化處理切片。

由于目前難以獲得商品化的高度純化的特異性CAC1抗體，故研究中沒有用免疫組化技術(shù)去驗(yàn)證原位雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。不過，之前有關(guān)結(jié)直腸癌的研究中對比了原位雜交法和免疫組化法檢測CAC1的表達(dá)結(jié)果，二者具有良好的一致性［7］。

根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR對不同胃癌細(xì)胞系和胃黏膜細(xì)胞系中CAC1表達(dá)水平的檢測，結(jié)合組織原位雜交的結(jié)果，可以看出，CAC1在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平均明顯高于相應(yīng)的胃正常組織和胃黏膜細(xì)胞系。因此，我們推測，CAC1對胃癌的某些生物學(xué)特性可能有一定影響，其表達(dá)升高可能有助于胃癌的形成和發(fā)展。

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