邵繼萍

（蘭州商學(xué)院 體育教學(xué)部，甘肅 蘭州 730020）

氧化壓力一般來源于自由基的過度產(chǎn)生或者抗氧化機(jī)制的退化.在肌肉細(xì)胞中，線粒體是產(chǎn)生氧化基團(tuán)的活性中心之一，產(chǎn)生包括過氧化根，過氧化氫，以及羥基在內(nèi)的多種氧化基團(tuán).最近關(guān)于線粒體產(chǎn)生一氧化氮的發(fā)現(xiàn)更是對運(yùn)動中氧化物的產(chǎn)生與線粒體的功能有一定的啟示.在適量的情況下，一氧化氮可以調(diào)節(jié)呼吸，但同時一氧化氮還可以與自由基發(fā)生反應(yīng)，比如與過氧化根反應(yīng)生成強(qiáng)氧化劑過氧化亞硝酸鹽.脂過氧化是一個復(fù)雜的過程.富含不飽和脂肪酸的細(xì)胞表面很容易受脂過氧化的影響，導(dǎo)致膜流動性與滲透性的下降，從而引起組織病變.

有限的以小鼠為模型的研究曾經(jīng)調(diào)查過訓(xùn)練是否可以預(yù)防心肌功能衰退，或者改善心肌缺血的狀況.但是到目前為止，還沒有關(guān)于丹參提取物對持續(xù)性訓(xùn)練的小鼠的骨骼肌抗氧化反應(yīng)的研究.本文旨在對這一問題進(jìn)行研究.

1 實驗材料與方法

丹參提取物為實驗室自制，提取物中丹參酮的含量為92.6%.

1.1 實驗動物

實驗方案已經(jīng)由中國實驗動物協(xié)會通過，實驗共使用50只雄性白鼠.白鼠在常規(guī)光控（12小時光照12小時黑暗交替）和溫控（20－22攝氏度恒溫）環(huán)境中飼養(yǎng)，水與食物自由吮食.50只白鼠被隨機(jī)分為5組：對照組（長期不動控制），持續(xù)性訓(xùn)練對照組（耐力運(yùn)動模型控制），低，中，高丹參提取物劑量組（分別為100，200，300mg/kg體重）丹參提取物治療組劑量（鼠尾草提取）.

表1 丹參提取對小鼠骨骼肌丙二醛水平的影響

1.2 訓(xùn)練程序

耐力運(yùn)動模型控制組小鼠接受持續(xù)性體能訓(xùn)練.長期不動控制組小鼠也接受相同的持續(xù)性訓(xùn)練，但會以不同劑量的丹參提取物喂養(yǎng).訓(xùn)練項目首先是為期四周的耐力訓(xùn)練，然后是為期四周的高強(qiáng)度訓(xùn)練.在動物對機(jī)械性跑步機(jī)熟悉兩天后，它們將以10米/分鐘的速度在坡度為0%的跑步機(jī)上每天跑10分鐘，跑一周.訓(xùn)練的時間和強(qiáng)度將會在一周后持續(xù)增加，至第四周時，動物們會以25米/分鐘的速度在坡度為0%的跑步機(jī)上跑每天40分鐘.第五到第八周時，訓(xùn)練強(qiáng)度以15米/分鐘開始，每20分鐘增加5米/分鐘直到速度為30米/分鐘（整個過程中坡度為10%）.小鼠會一直跑，直到不能再跟上跑步機(jī)的速度，撞到跑步機(jī)后的安全桿.這種狀態(tài)被定義為訓(xùn)練過度.這些動物在最后一次訓(xùn)練24小時后處死，剖取骨骼肌，保存在磷酸緩沖鹽溶液緩沖液里，以備馬上進(jìn)行丙二醛和超氧化物歧化酶水平檢測.

1.3 生化檢測

mda（丙二醛）水平檢測

mda，作為脂過氧化反應(yīng)后產(chǎn)生的自由基衡量指標(biāo)，由draper與hadley的雙重加熱法進(jìn)行測量.該方法的基本原理在于測量mda與tba（硫代巴比妥酸）反應(yīng)后產(chǎn)生的色譜變化.Mda水平以納摩/克蛋白為單位表示.

Sod（超氧化物歧化酶）水平檢測:

Sod活性以氯化硝基四氮唑藍(lán)為底物的還原反應(yīng)進(jìn)行檢測.一單元sod定義為為達(dá)到50%抑制作用需要的樣品量.

Gsh-px（谷光甘肽化氧化物）活性檢測:

Gsh-px活性以paglia and valentine方法檢測.所有試劑都是當(dāng)天現(xiàn)配，包括：150mM磷酸鉀緩沖液,5mM乙二胺四乙酸,0.5mM疊氮化鈉,2mM還原性谷光甘肽,0.24mM還原型輔酶,1 U ml-1谷胱甘肽還原酶.

Ldh（乳酸脫氫酶）活性檢測:

Ldh活性以氧化反應(yīng)方向進(jìn)行檢測.即以l-乳酸為底物產(chǎn)生丙酮酸，同時將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（簡稱：輔酶Ⅰ），還原為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原態(tài)（還原型輔酶Ⅰ）和氫.檢測反應(yīng)與此反應(yīng)耦合，即上述反應(yīng)生成的還原型輔酶Ⅰ還原非熒光底物刃天青鈉鹽，產(chǎn)生強(qiáng)熒光產(chǎn)物試鹵靈.

Ck和cke（肌酸激酶與膽堿酯酶）活性檢測:

Ck活性以自動分析儀在37攝氏度條件下進(jìn)行檢測.膽堿酯酶活性以膽堿酯酸儀檢測.

1.4 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果以平均值+_標(biāo)準(zhǔn)方差表示.分析方法包括spss;anova;snk.P值小于0.05被認(rèn)為統(tǒng)計相關(guān)

2 實驗結(jié)果與討論

ros可能通過激活信號傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)mrna的水平，來調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性.根據(jù)franco，抗氧化酶mrna水平的提高伴隨著蛋白氧化損傷的提高，這個發(fā)現(xiàn)支持以前關(guān)于氧化壓力和抗氧化酶mrna水平之間的關(guān)系的研究.Ros在體內(nèi)具有多樣的重要作用，比如在信號傳導(dǎo)中做第二信使，比如激活與氧化還原相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（包括ap-1和nf-kb）.

脂過氧化指氧化物與自由基通過氧化反應(yīng)破壞脂分子結(jié)構(gòu).脂是細(xì)胞膜的重要組成部分，所以，ros與自由基能夠通過催化脂過氧化從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡.Mda是脂過氧化的重要指標(biāo).

結(jié)果如表1所示.Mda在這里用來描述小鼠骨骼肌氧化損傷的水平.與對照組相比，該指標(biāo)在運(yùn)動組的小鼠中明顯增高（p<0.01）.與未以丹參提取物喂養(yǎng)的白鼠相比，丹參提取物的喂養(yǎng)能明顯降低該指標(biāo)（p<0.05-0.01）.

表2 丹參提取對小鼠骨骼肌超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平的影響

表3 丹參提取對小鼠骨骼肌乳酸脫氫酶活動的影響

表4 丹參提取對小鼠骨骼肌肌酸激酶和膽堿酯酶活動的影響

2.1 能顯著降低這些高參數(shù)(P<0.05-0.01)

過氧化陰離子將嚴(yán)重?fù)p壞細(xì)胞膜與生物大分子.sod，超氧化物歧化酶，在清理體內(nèi)過氧化陰離子中，具有重要作用.Sod特異性的催化過氧化物的歧化反應(yīng)，并生成過氧化氫與氧.過氧化氫被認(rèn)為是對人的精子危害最大的過氧化物.過氧化氫酶將進(jìn)一步將過氧化氫分解為氧和水.Sod與過氧化氫酶被用來治療實驗中過度扭轉(zhuǎn)所引起的睪丸損傷.在持續(xù)性訓(xùn)練的小鼠中，骨骼肌中sod與gsh-px的活性大幅度下降（表2，p<0.01）.但如果以丹參提取物喂養(yǎng)，sod與gsh-px活性提高，提高程度與喂養(yǎng)所用的丹參劑量成正比.這個結(jié)果表明丹參提取物可能增強(qiáng)這些小鼠骨骼肌中的sod與gsh-gx活性.

體內(nèi)多種組織與細(xì)胞中都含有乳酸脫氫酶，ldh，包括心臟，肝，腎，骨骼肌，大腦，紅細(xì)胞，肺，等等.該酶在體內(nèi)催化乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)，是細(xì)胞內(nèi)生成能量的重要反應(yīng).在持續(xù)性訓(xùn)練的小鼠骨骼肌中，ldh活性明顯提高（表 3，p<0.01）.在丹參提取物喂養(yǎng)的條件下，ldh活性提高，并與喂養(yǎng)量成正比（p<0.01）.

肌酸激酶在心臟和骨骼肌細(xì)胞的能量代謝中具有重要作用.在缺血條件下，該酶會在灌注過程中滲透到血液里，所以臨床上常以血清中肌酸激酶的含量為指標(biāo)來衡量心肌壞死的程度.肌酸激酶同工酶催化磷酸肌酸的生成.快速、突發(fā)、大量消耗atp的細(xì)胞會以磷酸肌酸為底物重新合成atp.

表4顯示的是丹參提取物對小鼠骨骼肌ck和cke活性的影響.小鼠骨骼肌ck和cke活性的提高與降低與持續(xù)性訓(xùn)練的增強(qiáng)與減弱成正比.丹參提取物很有可能通過抑制ck，降低cke活性，從而表現(xiàn)出不同的抗疲勞的效果.

3 結(jié)論

我們以上的研究是丹參提取物對持續(xù)性小鼠抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用的第一例研究.骨骼肌抗氧化酶，ldh和ck，表示出明顯的活性變化.丹參提取物在消炎，抗氧化方面具有強(qiáng)大的潛力，并在持續(xù)性訓(xùn)練的小鼠中具有明顯的抗疲勞作用.進(jìn)一步的研究將會對丹參的這一作用提供更深刻的見解.

〔1〕Dieli-Conwright CM,Spektor TM,Rice JC,Todd Schroeder E (2009).Hormone therapy attenuates exercise-induced skeletal muscle damage in postmenopausal women.J.Appl.Physiol.,107:853–858.

〔2〕Franco AA,Odom RS,Rando TA (1999).Regulation of antioxidant enzyme gene expression in response to oxidative stress and during differentiation of mouse skeletal muscle.Free Radic.Biol.Med.,27:1122–1132.

〔3〕Fulle S,Protasi F,Di Tano G,Pietrangelo T,Beltramin A,Boncompagni S,Vecchiet L,Fano G (2004).The contribution of reactive oxygen species to sarcopenia and muscle ageing.Exp.Gerontol.,39:17–24.

〔4〕Giulivi C,Poderoso JJ,Boveris A(1998).Production of nitric oxide by mitochondria.J.Biol.Chem.,273:11038-11043.Henderson D,Bielefeld EC,Harris KC,Hu BH(2006).The role of oxidative stress in noise-induced hearing loss.Ear Hear.,27:1-19.

〔5〕Khassaf M,McArdle A,Esanu C,Vasilaki A,McArdle F,Griffiths RD,Brodie DA,Jackson MJ(2003).Effect of vitamin C supplements on antioxidant defence and stress proteins in human lymphocytes and skeletal muscle.J.Physiol.,549:645–652.

〔6〕Liu CC,Huang CC,Lin WT,Hsieh CC,Huang SY,Lin SJ,Yang SC(2005).Lycopene supplementation attenuated xanthine oxidase and myeloperoxidase activities in skeletal muscle tissues of rats after exhaustive exercise.Br J.Nutr.,94:595–601.

〔7〕Pan SS (2008).Alterations of atrial natriuretic peptide in cardiomyocytes and plasma of rats after different intensity exercise.Scand J.Med.Sci.Sports,18:346–353.

〔8〕Yatabe Y,Miyakawa S,Miyazaki T,Matsuzaki Y,Ochiai N.(2003).Effects of taurine administration in rat skeletal muscles on exercise.J.Orthop.Sci.,8:415–419.

〔9〕Zhou LZ,Johnson AP,Rando TA(2001).NF kappa B and AP-1 mediate transcriptional responses to oxidative stress in skeletal muscle cells.Free Radic.Biol.Med.,31:1405–1416.