李運(yùn)生， 童彬彬， 劉曉蕊， 凌英會(huì)， 方富貴， 張運(yùn)海， 劉 亞

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036;2.安徽地方畜禽遺傳資源保護(hù)與生物育種省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

生長(zhǎng)素(Ghrelin)是一種生長(zhǎng)激素促分泌素受體的天然配基，廣泛表達(dá)于動(dòng)物胃、消化道、肺、心臟、乳腺等多個(gè)器官［1］，調(diào)控食物攝取和促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌［2］。生長(zhǎng)素在生殖器官如子宮內(nèi)膜、胎盤、睪丸、卵巢和胚胎中均有表達(dá)［3-4］，暗示其在生殖軸中起調(diào)控作用［5］。胚胎發(fā)育是生殖發(fā)生的重要過(guò)程，也是生殖研究的重點(diǎn)內(nèi)容。關(guān)于生長(zhǎng)素對(duì)哺乳動(dòng)物附植前胚胎發(fā)育的作用研究較少，且結(jié)果也不一致。在小鼠［6-7］和牛［8］胚胎發(fā)育過(guò)程中添加生長(zhǎng)素可抑制囊胚的發(fā)育效率。但在水牛［9］、綿羊［10］和豬［11］上，卻發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素可以促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育能力。鑒于生長(zhǎng)素在不同物種間的差異表現(xiàn)，有必要對(duì)其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

生長(zhǎng)素主要通過(guò)與其特異性受體GHSR-1a結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Kawamura［5］發(fā)現(xiàn)附植前胚胎發(fā)育過(guò)程中生長(zhǎng)素受體基因GHSR-1a mRNA僅在小鼠致密化、囊胚及孵化胚階段轉(zhuǎn)錄。而Du等［12］認(rèn)為綿羊早期胚胎各發(fā)育時(shí)期均有GHSR-1a表達(dá)。目前在豬的胚胎上，GHSR-1a的存在情況及其表達(dá)模式未有研究，生長(zhǎng)素在物種間的差異作用是否與其受體的表達(dá)模式相關(guān)亦未有報(bào)道。

本試驗(yàn)擬在豬孤雌胚培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長(zhǎng)素，研究其在豬孤雌胚早期發(fā)育中的作用及對(duì)發(fā)育速度的影響，并檢測(cè)豬孤雌激活胚胎不同發(fā)育時(shí)期GHSR-1a的轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)水平，以期探明生長(zhǎng)素及其受體GHSR-1a對(duì)哺乳動(dòng)物附植前胚胎發(fā)育的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬卵巢采自安徽合肥肥東福潤(rùn)屠宰場(chǎng)，置入38℃含青霉素及鏈霉素的生理鹽水保溫瓶中保存。

1.2 豬卵母細(xì)胞的獲得及體外成熟

參照Li［13］的方法，生理鹽水清洗卵巢后用18號(hào)針頭抽取2～6 mm卵泡，體式顯微鏡下挑選卵丘包裹完整，2層以上顆粒細(xì)胞層的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complex，COCs)，按照每50枚左右一孔的密度將COCs移入放有400 μl成熟培養(yǎng)液的四孔板，38.5℃、5%CO2、100%濕度的環(huán)境中體外成熟42～44 h。

1.3 豬孤雌胚的獲得

用0.1%透明質(zhì)酸酶脫除卵丘細(xì)胞，顯微鏡下選擇透明帶完整、卵周隙清晰、已排出第一極體的卵母細(xì)胞，并在預(yù)熱的 f2中洗滌3遍［13］。放入融合槽中用 1.56 kV/cm、80 μs、1 次直流電脈沖進(jìn)行電激活。移出后用胚胎培養(yǎng)液(Porcine zogyte medium 3，PZM3)［14］將 卵 母 細(xì) 胞 洗 滌 3遍，轉(zhuǎn)移到覆蓋石蠟油的化學(xué)輔助激活液(PCC，PZM3+10 μg/ml松胞素 B+10 μg/ml環(huán)已酰亞胺)中作用4 h，最后移入PZM3胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃、5%CO2、飽和濕度。

1.4 間接免疫熒光染色

參考周娜汝［15］的方法，一抗孵育時(shí)在DPBS+1%BSA中加入 GHSR-1a抗體(ABcam公司生產(chǎn)，ab95250)(1∶200稀釋)，對(duì)照組用PBS代替。胚胎轉(zhuǎn)移到玻片中壓片并封片，置于激光共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1000)下掃描拍攝。每組采用相同的曝光值采集圖像并用Image J軟件分析計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.5 胚胎細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

胚胎RNA提取選用Qiagen公司試劑盒RNeasy Micro Kit，No.74004，總RNA反轉(zhuǎn)錄采用Qiagen公司試劑盒QuantiTect Reverse Transcription Kit，No.205311。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成及熒光定量PCR

GenBank中查找GHSR序列(NM_032075.3)，設(shè)計(jì)引物為正向:5'-AACGACTCGCTAGTGGAGGA-3'，反 向:5'-GAAGCGTGACACTACCAGCA-3'。引物均由生工生物工程有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GHSR-1a的相對(duì)表達(dá)量。采用2-△△CT(Livak)法分析GHSR-1a的表達(dá)水平。

1.7 不同濃度生長(zhǎng)素對(duì)豬孤雌胚早期發(fā)育的影響

在豬的孤雌激活體外培養(yǎng)液中添加不同濃度生長(zhǎng)素［0 mg/L(對(duì)照)、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L］，分別于培養(yǎng) 30～32 h、44～48 h、80 ～82 h、104 ～108 h、146 ～148 h 時(shí)統(tǒng)計(jì)其 2-細(xì)胞胚胎數(shù)、4-細(xì)胞胚胎數(shù)、8-細(xì)胞胚胎數(shù)、致密桑葚胚數(shù)及囊胚發(fā)育數(shù)，計(jì)算其卵裂率、囊胚率、桑葚胚率。試驗(yàn)重復(fù)5次。另外，在豬的孤雌激活體外培養(yǎng)液中添加不同濃度生長(zhǎng)素［0 mg/L(對(duì)照)、0.1 mg/L、1.0 mg/L、10.0 mg/L、100.0 mg/L］，分別于培養(yǎng) 24 h、40 h、72 h、102 h、132 h 時(shí)統(tǒng)計(jì)其 2-細(xì)胞胚胎數(shù)、4-細(xì)胞胚胎數(shù)、8-細(xì)胞胚胎數(shù)、桑葚胚數(shù)及囊胚發(fā)育數(shù)，計(jì)算其卵裂率、囊胚率，比較不同組間發(fā)育速度。試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.8 豬附植前胚胎中GHSR-1a mRNA和GHSR-1a蛋白檢測(cè)

分別在2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、桑葚胚期、囊胚期收集胚胎［15］，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)豬孤雌激活胚GHSR-1a mRNA在上述各階段的表達(dá)水平，試驗(yàn)重復(fù)3次。收集2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、桑葚胚期與囊胚期的豬孤雌發(fā)育胚胎(每組20枚)，采用間接熒光免疫法檢測(cè)不同發(fā)育階段胚胎中GHSR-1a蛋白水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 11.5軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)素濃度對(duì)豬孤雌胚胎早期發(fā)育的影響

如表1所示，添加10.0 mg/L生長(zhǎng)素組的豬孤雌胚胎4-細(xì)胞發(fā)育率、8-細(xì)胞發(fā)育率和桑葚胚率均顯著高于對(duì)照組和0.1 mg/L組(P＜0.05);添加100.0 mg/L生長(zhǎng)素組的豬孤雌胚胎4-細(xì)胞發(fā)育率、8-細(xì)胞發(fā)育率均顯著高于添加0.1 mg/L組(P＜0.05)。添加0.1 mg/L和1.0 mg/L生長(zhǎng)素組在各時(shí)期胚胎發(fā)育效率均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

如圖1所示，胚胎發(fā)育24 h后，添加生長(zhǎng)素的試驗(yàn)組豬孤雌胚2-細(xì)胞胚胎的發(fā)育速率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);胚胎發(fā)育40 h、72 h、102 h時(shí)，添加10.0 mg/L生長(zhǎng)素組豬孤雌胚的4-細(xì)胞胚胎、8-細(xì)胞胚胎及桑葚胚發(fā)育速率明顯快于對(duì)照組(P＜0.05)，其他組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05);胚胎發(fā)育132 h后，添加生長(zhǎng)素的試驗(yàn)組豬孤雌胚囊胚的發(fā)育速率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同濃度生長(zhǎng)素對(duì)豬孤雌胚胎早期發(fā)育能力的影響Table 1 Effects of different concentrations of ghrelin on the in vitro developmental competence of porcine parthenogenetic embryos

2.2 豬孤雌胚各發(fā)育時(shí)期GHSR-1a的表達(dá)

熒光定量 PCR結(jié)果(圖2)顯示，GHSR-1a mRNA在豬孤雌胚早期發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，其中在2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期及桑葚胚期表達(dá)量無(wú)顯著差異，囊胚期表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。

2.3 在豬孤雌胚早期發(fā)育過(guò)程中GHSR1a蛋白的表達(dá)量

從圖3和圖4可以看出，GHSR-1a蛋白在豬孤雌胚早期發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均能檢測(cè)到，囊胚期的表達(dá)量顯著低于4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期和桑葚胚期(P＜0.05)。

圖1 添加生長(zhǎng)素后豬孤雌胚早期發(fā)育速率的變化Fig.1 The dose-dependent effects of ghrelin on the early development rate of porcine parthenogenetic embryos

圖2 豬孤雌胚胎早期發(fā)育各時(shí)期GHSR-1a mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative mRNA expression of GHSR-1a at various developmental stages ofporcineparthenogenetic embryos

3 討論

近年來(lái)，生長(zhǎng)素對(duì)生殖器官的作用不斷被證實(shí)，但其在胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能還存在爭(zhēng)議。2003年，日本研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)向小鼠胚胎體外培養(yǎng)液中添加100 nm/L生長(zhǎng)素時(shí)可抑制小鼠胚胎發(fā)育［5］。習(xí)海濤［7］發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)基中添加 0.1 mg/L的生長(zhǎng)素顯著降低了小鼠自然受精胚和孤雌胚的桑葚胚及囊胚發(fā)育率，但進(jìn)一步提高生長(zhǎng)素的添加濃度后，桑葚胚率和囊胚率又有一定程度的回升;而對(duì)于體外受精胚，添加1.0 mg/L生長(zhǎng)素顯著降低了其囊胚發(fā)育率，提高生長(zhǎng)素的濃度后，囊胚率并沒(méi)有明顯的回升趨勢(shì)。另有研究報(bào)道在培養(yǎng)基中添加50.0 mg/L的生長(zhǎng)素顯著提高了水牛孤雌胚的囊胚發(fā)育率［9］。本研究結(jié)果顯示，胚胎培養(yǎng)過(guò)程中添加10.0 mg/L生長(zhǎng)素可以顯著提高豬孤雌胚的4-細(xì)胞發(fā)育率、8-細(xì)胞發(fā)育率、桑葚胚率及囊胚發(fā)育率(P＜0.05)，但100.0 mg/L的添加濃度降低了豬孤雌胚的囊胚發(fā)育率，這與Zhang等人［11］研究結(jié)果一致。推測(cè)生長(zhǎng)素對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育會(huì)產(chǎn)生一定促進(jìn)作用，但在不同物種和不同來(lái)源的胚胎及生長(zhǎng)素的添加濃度上表現(xiàn)不一。

圖3 GHSR1a蛋白在豬孤雌胚早期發(fā)育中的表達(dá)Fig.3 GHSR1a expression at various developmental stages of porcine parthenogenetic embryos

圖4 豬孤雌胚胎早期發(fā)育各時(shí)期GHSR-1a的表達(dá)量Fig.4 GHSR-1a levels at various developmental stages of porcine parthenogenetic embryos

向牛體外成熟的卵母細(xì)胞中添加800 pg/ml的生長(zhǎng)素后發(fā)現(xiàn)，成熟18 h后MII期卵母細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，但成熟24 h時(shí)卵母細(xì)胞數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異，成熟后體外受精時(shí)，成熟18 h的卵母細(xì)胞形成的囊胚率顯著高于成熟24 h組［8］。提示我們生長(zhǎng)素可能在卵母細(xì)胞發(fā)育或胚胎發(fā)育過(guò)程中起作用。本研究結(jié)果表明，添加10.0 mg/L生長(zhǎng)素組豬孤雌胚胎4-細(xì)胞胚胎、8-細(xì)胞胚胎及桑葚胚發(fā)育速率明顯快于對(duì)照組(P＜0.05)，但2-細(xì)胞胚和囊胚在發(fā)育速度上與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。說(shuō)明生長(zhǎng)素有可能會(huì)促進(jìn)胚胎的早期發(fā)育速度。從4-細(xì)胞期到桑葚胚期間其特異性受體GHSR-1a表現(xiàn)出的mRNA高表達(dá)模式與胚胎發(fā)育速度相一致，推測(cè)生長(zhǎng)素通過(guò)GHSR-1a作用于胚胎發(fā)育。但生長(zhǎng)素通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)了胚胎發(fā)育的速度，還需要進(jìn)一步研究。

2008年，Du等［12］檢測(cè)了綿羊卵母細(xì)胞和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎生長(zhǎng)素及其受體基因GHSR-1a mRNA轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)在附植前胚胎不同發(fā)育階段均有表達(dá)，其中GHSR-1a mRNA轉(zhuǎn)錄水平從GV期到MII期依次遞減，在2-細(xì)胞期升高，至囊胚期保持穩(wěn)定。Kawamura等［5］研究結(jié)果表明小鼠體外受精胚自桑葚胚以后的附植前胚胎均檢測(cè)到生長(zhǎng)素及其受體GHSR-1a的表達(dá)，表達(dá)從桑葚胚到囊胚呈增加趨勢(shì)，而此前各時(shí)期則沒(méi)有生長(zhǎng)素 及GHSR-1a的表達(dá)。在本研究中，GHSR-1a mRNA在豬孤雌胚胎早期發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均可被檢測(cè)到，在2-細(xì)胞期轉(zhuǎn)錄水平較高，在4-細(xì)胞期降低，8-細(xì)胞期回升，至囊胚期迅速下降。這可能是由于在2-細(xì)胞期之前，豬胚內(nèi)還存在大量母源mRNA，而在4～8-細(xì)胞期發(fā)生胚胎基因組激活，原來(lái)的母源mRNA大部分降解，導(dǎo)致4-細(xì)胞期GHSR-1a mRNA降低，而8-細(xì)胞期時(shí)，胚胎基因組已激活轉(zhuǎn)錄，因此GHSR-1a mRNA回升。GHSR-1a在這段時(shí)間的變化起何種作用，還需要進(jìn)一步研究。在本研究中發(fā)現(xiàn)GHSR-1a mRNA與蛋白在不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)豐度的變化趨勢(shì)并不完全一致，這可能是由于從mRNA到蛋白還受諸如mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率、蛋白壽命等多種因素影響所致。

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