夏金嬋， 何奕昆

(1.河南中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008;2.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048)

低溫是植物經(jīng)常遭受的一種環(huán)境脅迫因子，它限制作物的產(chǎn)量，影響植物的自然分布［1-2］。剖析植物對低溫的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制、提高其抗低溫能力在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要意義。為了適應(yīng)和抵抗低溫脅迫，在長期進(jìn)化過程中植物形成了相應(yīng)的應(yīng)答保護(hù)機(jī)制。目前，通過篩選和克隆的方法已得到了許多與冷馴化信號途徑相關(guān)的基因，例如 CBF、COR、KIN、RD 等［3］，對它們的功能分析為我們繪制了植物抗冷反應(yīng)的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)，其中ICE1-CBF-COR通路在植物的冷馴化過程中起重要作用。在冷馴化過程中，膜是最先受到低溫影響的細(xì)胞結(jié)構(gòu)［4］;低溫誘導(dǎo)的質(zhì)膜硬化可導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排，誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+的瞬時增加［5］;IP3作為重要的信號分子介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣庫儲存的Ca2+釋放到胞質(zhì)，從而調(diào)控CBF和COR基因的表達(dá)［6］。ICE1基因編碼一個MYB類型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子，在上游調(diào)節(jié)CBF和其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，提高抗冷性［7］。HOS1蛋白通過泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解負(fù)調(diào)控ICE1［8］。在不依賴于CBF的途徑中，轉(zhuǎn)錄因子 HOS9、HOS10、RNA修飾和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在調(diào)節(jié)有關(guān)抗冷基因的表達(dá)和提高植物抗冷能力方面具有至關(guān)重要的作用［9-10］。植物對冷脅迫的分子反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)成為目前科學(xué)研究的熱門領(lǐng)域，近幾年的研究成果為改良作物的抗冷能力打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

有研究結(jié)果表明，一些植物激素也參與了植物的抗逆反應(yīng)過程。脫落酸(ABA)能夠提高低溫條件下植物的抗氧化能力，降低過氧化物(ROS)的積累［11］，誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，但其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低溫誘導(dǎo)的表達(dá)量［12］。外施油菜素內(nèi)酯(BR)在植物的生長發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)節(jié)功能，例如參與光形態(tài)建成，促進(jìn)植物細(xì)胞的生長、分裂和分化等。BR不僅能夠阻止低溫對葉綠體的破壞，提高植物的抗冷能力，還能夠恢復(fù)高鹽脅迫條件下幼苗的生長狀況［13］，但是BR在植物抗逆反應(yīng)過程中所起作用的分子機(jī)制還不清楚。擬南芥的DWF4基因編碼一個類固醇類C22α-羥化酶，催化油菜素內(nèi)酯的生物合成過程。該基因在植物活躍生長的組織中表達(dá)，例如根與莖的頂端組織以及根與莖的結(jié)合部位［14］，表達(dá)量受乙烯和茉莉酸甲酯的調(diào)控［15］，參與植物的抗高溫反應(yīng)過程［16］，超表達(dá)DWF4的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出外加BR的特征，包括較長的下胚軸等［17］。本試驗采用反向遺傳學(xué)的方法，利用擬南芥DWF4基因缺失突變體dwf4，研究敲除DWF4基因后擬南芥對低溫脅迫的響應(yīng)，探討該基因在抗低溫脅迫反應(yīng)過程中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

試驗中所用的野生型擬南芥(Arabidopsis)和dwf4突變體均為Col-0生態(tài)型背景。在培養(yǎng)皿中無菌培養(yǎng)擬南芥，先對種子進(jìn)行表面消毒，4℃同步化處理2～3 d后，均勻地種在含有0.8%瓊脂的1/2MS培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件:溫度為22℃，光照度為100 μmol/(m2·s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗交替。低溫脅迫處理:在培養(yǎng)皿中生長21 d的材料不經(jīng)冷馴化置于-20℃中1 h，4℃解凍12 h，于22℃、16 h光照/8 h黑暗中恢復(fù)7 d。

1.2 生理指標(biāo)的測定

將在正常培養(yǎng)基上生長14 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗移到4℃條件下處理2 d，測定野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫脅迫下可溶性糖和脯氨酸含量［18-19］。在營養(yǎng)土中生長21 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下2 d進(jìn)行低溫處理，測定葉綠素含量［20］。相對電滲透率的測定參考Ishitani等的方法［21］，其溫度處理過程為:初始溫度為0℃，在此溫度穩(wěn)定30 min后降至-1℃，-1℃維持1 h后加入碎冰，而后以2℃/h速度降溫至-12℃，每一個溫度梯度取1個樣。將在正常培養(yǎng)基上生長10 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下進(jìn)行低溫處理2 d，測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)的含量，測定方法參照文獻(xiàn)［22］、［23］。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR

在正常培養(yǎng)基上生長10 d的野生型擬南芥和dwf4突變體幼苗，移到4℃條件下進(jìn)行低溫處理，分別在0 h、12 h、24 h時取樣。用 TRIZOL試劑(Sigma，USA)提取總 RNA，用 AMV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa，Dalian)合成第一條 cDNA。利用 Agilent Strata-gene熒光定量PCR儀(Mx3005P)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。熒光染料試劑盒采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，日本)，以稀釋10倍的植物cNDA為模板。20 μl PCR反應(yīng)體系中含1×SYBR Premix Ex Taq、上下游引物各 0.2 μmol/L、2 μl稀釋的 cDNA，使用UBQ10(Polyubiquitin 10)作為內(nèi)參對目標(biāo)基因進(jìn)行相對定量。

2 結(jié)果

2.1 DWF4基因調(diào)節(jié)擬南芥對低溫脅迫的反應(yīng)過程

DWF4(基因編號AT3g50660)位于擬南芥第3條染色體上，其中包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，編碼 513個氨基酸［14］。為了進(jìn)一步探討DWF4的生物學(xué)功能，從擬南芥信息資源中心(The Arabidopsis Information Resource，TAIR)獲得DWF4基因的T-DNA插入突變體(SALK_020761)，其插入位置在第4個外顯子上。RTPCR結(jié)果顯示由于T-DNA的插入，DWF4基因被敲除(圖1)，將該突變體命名為dwf4。將在培養(yǎng)皿中正常生長21 d的野生型與dwf4突變體置于-20℃處理1 h，之后在4℃下解凍12 h，再置于正常培養(yǎng)條件下恢復(fù)生長7 d。我們發(fā)現(xiàn)dwf4突變體在受到低溫脅迫后能夠繼續(xù)生長出新的葉片，而野生型擬南芥在受到低溫脅迫后大多數(shù)葉片的葉綠素受到破壞而白化死亡(圖2)。低溫脅迫能夠?qū)е轮参锏募?xì)胞受到傷害，造成相對電導(dǎo)率的變化。相對電導(dǎo)率能夠反映低溫脅迫對細(xì)胞膜的傷害程度，是細(xì)胞膜在逆境條件下生理活性高低的重要指標(biāo)之一。相對電導(dǎo)率低，說明細(xì)胞膜的損傷程度小，進(jìn)而細(xì)胞受到的傷害就小，抗寒能力就強(qiáng)。我們發(fā)現(xiàn)野生型和dwf4突變體經(jīng)過低溫處理后其相對電導(dǎo)率都表現(xiàn)出增加的趨勢，但是dwf4突變體的相對電導(dǎo)率比野生型的低，例如，經(jīng)過-9℃低溫處理，dwf4突變體的相對電導(dǎo)率為62%，而野生型的為75%(圖3)。植物中葉綠體對低溫脅迫相當(dāng)敏感，低溫脅迫會造成葉綠素的降解。在正常條件下，dwf4突變體的葉綠素含量比野生型的稍低，但是經(jīng)過低溫處理后野生型的葉綠素含量下降比較明顯，而dwf4突變體的葉綠素含量變化不大，導(dǎo)致dwf4突變體的葉綠素含量比野生型的還要高(圖4)，說明dwf4突變體抗冷能力強(qiáng)。

圖1 DWF4基因在野生型(WT)與dwf4突變體中的表達(dá)Fig.1 Expression of DWF4 gene in wild-type and dwf4 mutant plants

2.2 低溫脅迫下dwf4突變體可溶性糖和游離脯氨酸含量變化

圖2 野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫處理前(左)和低溫處理后(右)的表型Fig.2 The phenotypes of wild-type and dwf4 mutant plants before(left)or after(right)cold stress

圖3 野生型擬南芥和dwf4突變體在不同低溫條件下的相對電導(dǎo)率Fig.3 Relative electronic conductivity of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

圖4 低溫條件下野生型擬南芥和dwf4突變體的葉綠素含量Fig.4 Chlorophyll contents of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

在逆境條件下，植物會積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，例如可溶性糖和脯氨酸，用于平衡滲透壓對胞質(zhì)的損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，其含量的多少反映其抗逆能力的大?。?1，24］。因此，測定植物體在低溫脅迫條件下可溶性糖和脯氨酸的含量，在一定程度上可以判斷植物對低溫脅迫的抵抗能力。從圖5中可以看出，正常生長條件下dwf4突變體的可溶性糖與脯氨酸的含量都比野生型的高，分別是野生型的1.29與5.10倍。低溫處理后dwf4突變體和野生型的可溶性糖含量均有所提高，但此時dwf4突變體的可溶性糖與脯氨酸含量仍然比野生型的高，分別是野生型的1.32和6.40倍。低溫脅迫條件下，dwf4突變體中可溶性糖和脯氨酸的快速積累可能與相關(guān)的基因表達(dá)活躍有關(guān)。

圖5 野生型擬南芥和dwf4突變體在低溫脅迫下可溶性糖(A)和脯氨酸(B)含量Fig.5 Soluble sugar(A)and proline(B)contents of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress

2.3 DWF4負(fù)調(diào)控RD29A基因和COR47基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步探討dwf4突變體抗低溫脅迫的分子機(jī)制，選擇參與低溫脅迫反應(yīng)的CBF轉(zhuǎn)錄因子與下游基因RD29A和COR47，對它們的表達(dá)量進(jìn)行分析。實(shí)時熒光定量 PCR檢測結(jié)果表明，CBF1、CBF2、CBF3的表達(dá)量在低溫處理條件下升高，但在dwf4突變體與野生型中的表達(dá)量并沒有明顯區(qū)別(圖6)。RD29A的表達(dá)量在突變體和野生型中都受低溫脅迫的誘導(dǎo)，而且在突變體中的誘導(dǎo)表達(dá)量高，表達(dá)時間早。例如，在正常生長條件下，dwf4突變體中RD29A的表達(dá)量是野生型的1.22倍，在低溫處理12 h時，dwf4突變體中RD29A的表達(dá)量是野生型中的1.40倍。在低溫脅迫條件下dwf4突變體中COR47的表達(dá)量也高于野生型(圖7)，因此推測DWF4基因負(fù)調(diào)控RD29A和COR47的表達(dá)。

2.4 野生型和dwf4突變體中過氧化物酶基因的表達(dá)差異

圖6 野生型和dwf4突變體在低溫處理下CBF基因的表達(dá)量(以UBQ10作為內(nèi)參)Fig.6 The expression levels of CBF gene of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress(UBQ10 internal control)

低溫脅迫能引起植物體內(nèi)活性氧的積累，從而對細(xì)胞造成傷害，抑制生長［11］。硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)含量是測定植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和自由基形成的一個重要指標(biāo)。為了驗證低溫脅迫條件下dwf4突變體抗氧化能力的強(qiáng)弱，我們檢測了在不同條件下野生型和dwf4突變體中TBARS含量。結(jié)果表明，在正常生長條件下dwf4突變體中TBARS含量比野生型中的高，低溫脅迫能使擬南芥植株中TBARS含量升高，但dwf4突變體中TBARS含量仍高于野生型，即dwf4突變體中過氧化物的積累比野生型中的多(圖8)。但是，dwf4突變體抵抗低溫脅迫的能力卻比野生型強(qiáng)，為此我們用實(shí)時熒光定量PCR檢測了抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)水平的變化。過氧化物酶在清除植物體內(nèi)過氧化物毒害方面起著重要作用，是植物抗氧化防御體系中的一個重要組成成分，參與抗逆反應(yīng)。我們檢測了過氧化物酶基因Prx22(AT2g38380)和Prx69(AT5g64100)表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，dwf4突變體中Prx22和Prx69的表達(dá)量就比野生型中的高(圖8)，這對低溫條件下dwf4突變體中高含量的過氧化物所產(chǎn)生的毒害起到了很好的抑制作用。

圖7 野生型和dwf4突變體在低溫處理下RD29A基因(A)和COR47基因(B)的表達(dá)量(以UBQ10作為內(nèi)參)Fig.7 The expression levels of RD29A gene(A)and COR47 gene(B)of wild-type and dwf4 mutant plants induced by cold stress(UBQ10 as internal control)

圖8 野生型和dwf4突變體中低溫條件下的TBARS含量(A)以及過氧化物酶Prx22與Prx69表達(dá)量(B)(以UBQ10作為內(nèi)參)Fig.8 TBARS content(A)and the expression levels of peroxidase genes Prx22 and Prx69(UBQ10 as internal control)(B)in wild-type and dwf4 mutant plants under cold stress

3 討論

在世界范圍內(nèi)，低溫是一個重要的環(huán)境因子，影響植物的分布，限制作物的產(chǎn)量。低溫不僅能直接對細(xì)胞產(chǎn)生傷害導(dǎo)致植株的死亡，還可以造成氧化與滲透脅迫。為了克服這種限制因素提高農(nóng)作物產(chǎn)量，研究植物抗冷反應(yīng)分子機(jī)制，進(jìn)而通過分子生物學(xué)手段提高農(nóng)作物的抗冷能力，顯得至關(guān)重要。本研究中我們第一次發(fā)現(xiàn)敲除DWF4基因能夠提高擬南芥的抗冷能力。

擬南芥dwf4突變體中，油菜素內(nèi)酯(BR)合成過程中的一個限速酶C22α-類固醇水解酶發(fā)生缺失突變，導(dǎo)致突變體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量減少［17］。dwf4突變體表現(xiàn)為極度矮化、葉片圓而短小卷曲、側(cè)根多且短、葉色深綠、下胚軸短且開花晚等特征。本試驗發(fā)現(xiàn)缺失突變體dwf4的抗冷能力明顯高于野生型。低溫脅迫條件下dwf4突變體中高含量的可溶性糖和脯氨酸降低了細(xì)胞水勢，有利于減少低溫條件下滲透脅迫對植物的損傷。特別是脯氨酸含量，在正常生長條件下，dwf4突變體中脯氨酸的含量就是野生型的6.4倍，這與Strizhov等［25］的發(fā)現(xiàn)一致。油菜素內(nèi)酯能夠模擬黑暗對P5CS1-GUS表達(dá)的抑制，從而導(dǎo)致ABA處理或干旱脅迫下植株脯氨酸含量下降［25］，而dwf4突變體中油菜素內(nèi)酯含量低而導(dǎo)致細(xì)胞中脯氨酸含量升高。BR是一種新型植物激素，在植物體內(nèi)含量極低，但生理活性很高，不僅對植物的生長發(fā)育有影響，與植物抗性也有一定的關(guān)系，外用BR處理油菜和番茄植株可以增強(qiáng)它們的耐熱性［26］，還可以增強(qiáng)油菜和擬南芥的抗干旱和抗凍能力［27］。dwf4突變體體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量低而抗凍性強(qiáng)的分子機(jī)制可能與外施油菜素內(nèi)酯后植株抗性增強(qiáng)的分子機(jī)制不同。Kagale等用BR處理擬南芥和油菜，發(fā)現(xiàn)CBF的表達(dá)量在擬南芥中只有微量變化，在油菜中根本沒有變化，下游的RD29A、COR47基因表達(dá)明顯高于對照［27］。我們也發(fā)現(xiàn)在低溫條件下dwf4突變體中CBF基因的表達(dá)量與野生型中的并沒有明顯區(qū)別，而RD29A和COR47的表達(dá)則高于野生型，說明BR對植物抗冷能力的調(diào)控可能不依賴CBF轉(zhuǎn)錄因子而是通過其他因子影響下游基因RD29A和COR47。許多非生物脅迫，例如干旱、高鹽、低溫等，都可以誘導(dǎo)過氧化物的產(chǎn)生，對植物體造成氧化脅迫，損傷DNA和蛋白質(zhì)分子，抑制植物正常的生長和發(fā)育［28］。研究發(fā)現(xiàn)，盡管DWF4缺失導(dǎo)致突變體中過氧化物含量的增加，但是dwf4突變體中高表達(dá)的過氧化物酶Prx22與Prx698，對過氧化物的毒害起到了很好的抑制作用，這2個基因都屬于植物特有的過氧化物酶(Ⅲ)家族，我們推測該家族基因的高表達(dá)可能是dwf4突變體具有強(qiáng)抗冷能力的重要原因。同時，我們也注意到dwf4突變體的一些表型特征，例如下胚軸短、葉片圓而肥厚、葉色深綠等，一般在抗凍植物中多見，例如，過量表達(dá)CBF轉(zhuǎn)錄因子的植株［29］。野生型植株在低溫下生長數(shù)日到數(shù)月也會表現(xiàn)出矮化、葉色深綠并且葉片增厚的特征［18］，這也說明在正常生長條件下dwf4突變體中可能有抗冷相關(guān)基因的表達(dá)，我們的研究也證明在正常情況下dwf4突變體中RD29A基因的表達(dá)量就高于野生型。

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