張 莉，李文瓊

（1．皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安237012；2．蘭州軍區(qū)疾病預防控制中心，甘肅 蘭州730020）

蕨菜又名拳頭菜，如意菜，龍爪菜等，含有多種對人體有益的營養(yǎng)成分［1-2］。近年來已成為深受人們熱愛的山野菜［2-4］。蕨菜中含有豐富的黃酮類物質，其含量高達7．28%［5］，目前，研究發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮具有抗氧化以及增強機體免疫功能等保健作用［4-7］。目前，有關蕨菜化學成分分析，尤其是黃酮類化合物的研究較多［5-7］，多糖具有生理功能［8-9］，但對于蕨菜多糖的相關研究報道較少，本文以皖西大別山產出野生蕨菜為原料，對其多糖的提取條件進行相關研究，多糖提取的原料也可采用提取黃酮類化合物后的殘渣，因此本研究為蕨菜的進一步的開發(fā)，綜合利用蕨菜資源提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

蕨菜：2014年4月購于安徽霍山縣。

蕨菜粉：新鮮蕨菜103℃烘箱干燥，粉碎，過40目篩。

1．2 儀器及試劑

1．2．1 儀器

TD5-2自動離心機（長沙平凡儀器表有限公司）；HH-2恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；TU-1901型紫外可見光分光光度計（北京普析通用儀器設備有限公司）；101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱干燥箱（上海浦東躍欣科學儀器廠）；FA1004型電子天平（上海精科天平）等。

1．2．2 試劑

無水乙醚，無水乙醇，葡萄糖，濃硫酸，苯酚等均為國產分析純。

1．3 實驗方法

1．3．1 蕨菜粉的脫脂處理

取蕨菜粉放于烘箱，103℃烘至恒重，將蕨菜粉用濾紙包成濾紙包，用無水乙醚作為提取劑，水浴45℃加熱，索氏提取法脫脂。直到洗脫液無色，拿出濾紙包，放在通風處等乙醚揮發(fā)到氣味比較淡時放入烘箱，103℃烘至恒重。

1．3．2 蕨菜粉的醇處理

把脫脂后的濾紙包放入索氏提取器，用無水乙醇作為提取劑，90℃恒溫水浴加熱，直到提取筒內液體為無色，脫醇溶性雜質。拿出過濾好的紙包，放在通風處讓乙醇揮發(fā)至醇味比較淡時放進干燥箱中，103℃烘至恒重。

1．3．3 蕨菜多糖含量的測定：苯酚硫-酸法［10-11］

（1）繪制葡萄糖標準曲線［12］

葡萄糖標準品在105℃下烘干至恒定重量后，準確稱取0．100 0g置于100mL燒杯中加20mL蒸餾水溶解，轉移至100mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻備用，濃度為1mg／mL，即為儲備液。將儲備液稀釋10倍作為標準溶液，濃度為0．1mg／mL。

準確移取葡萄糖標準溶液0．0、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL于試管中，補水至2mL，分別加入1mL 6%苯酚溶液，搖勻后迅速加入5mL濃硫酸，搖勻。將各試管于40℃水浴保溫30min后取出，冷水浴冷卻至室溫，在490nm處測其吸光度，以試劑空白作參比。得到回歸方程：A＝9．557 1C-0．091 9，R2＝0．993 3。

（2）樣品吸光度的測定

分別從樣液中取0．5mL溶液稀釋20倍后，取1．0mL稀釋液于試管中，按標準曲線測定方法測定吸光度。計算提取率。

1．3．4 單因素實驗

（1）料液比單因素實驗［13］

分別稱取蕨菜干粉置于錐形瓶中（n＝2），設定水浴溫度為70℃，提取時間為2h，并且料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50，水浴加熱回流提取。提取結束，過濾，濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測定其中多糖含量。

（2）提取時間單因素實驗［13］

分別稱取蕨菜干粉置于錐形瓶中（n＝2），設定料液比為1∶20，提取溫度70℃，分別設定提取時間為1h，2h，3h，4h，5h，水浴加熱浸提。提取結束，過濾，濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測定其中多糖含量。

（3）浸提溫度單因素實驗［13］

分別稱蕨粉干粉置于錐形瓶中（n＝2），設定固液比為1∶20，提取時間2h，分別設定提取溫度為50℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，2小時后，提取結束，過濾，濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測定其中多糖含量。

1．3．5 正交試驗因素水平［14-15］

在單因素實驗的基礎上，選用L9（33）正交實驗，正交因素水平如下：

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2．1 蕨菜粉預處理去雜質分析

在對蕨菜粉進行預處理時，經(jīng)過無水乙醚脫脂，無水乙醇去除醇溶性雜質，由公式：醇溶性物質含量（%）＝（未脫去醇溶性物質濾紙包質量-已脫去醇溶性物質濾紙包質量）÷蕨菜粉質量×100%

表2 蕨菜粉醇溶性雜質

從表2知，蕨菜內含有醇溶性物質，經(jīng)過無水乙醇的處理，蕨菜包的質量明顯減少，經(jīng)過計算，得出醇溶性物質含量為2．76%。

2．2 單因素實驗結果

2．2．1 料液比對蕨菜多糖提取率的影響

由圖1可知，隨料液比的加大，多糖提取率漸漸提高，固液比從1∶10到1∶20增長快速直至料液比1∶20之后，多糖提取率提高不明顯。且考慮到溶劑量的加大為后續(xù)的濃縮等步驟增加負擔，因此，最合適的料液比為1∶20。

2．2．2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2可知，提取時間小于3h時，隨著提取時間的增加，提取率明顯提高，3h后整個曲線慢慢平穩(wěn)，最后趨于穩(wěn)定，接著增加提取時間，但曲線還是趨于平緩，由此得出提取時間最優(yōu)為3h。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2．2．3 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，從50℃到80℃，隨著提取溫度的升高，多糖得率呈現(xiàn)出先增加后下降的上升趨勢，從80℃到90℃，提取溫度升高，多糖得率出現(xiàn)下降，因此，蕨菜多糖提取的最佳溫度為80℃。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2．3 正交試驗結果與分析

根據(jù)表3、4知，極差R剖析得出，蕨菜多糖的提取率影響因素主順序為A＞B＞C。即固液比對蕨菜多糖的提取率影響最小，浸提時間其次，而浸提溫度對蕨菜多糖的提取率影響最大，對提取效果影響顯著。最優(yōu)提取工藝：A3B3C2，提取率：6．23%。

表3 L9（34）正交試驗結果分析表

表4 L9（34）正交方差分析

2．4 驗證實驗

用正交試驗得出的最佳條件A3B3C2，即提取溫度為90℃，提取時間為4h，固液比為1∶20，進行驗證實驗。樣品量1．000 0g，平行實驗3組。

表5 驗證實驗結果

3次重復實驗表明，該方法重現(xiàn)性好，結果穩(wěn)定可靠。

3 小結

通過正交試驗法優(yōu)化蕨菜多糖的提取工藝條件，對蕨菜多糖提取率的影響因素進行了排序為：A＞B＞C，即最佳提取工藝為A3B3C2，浸提溫度為90℃，浸提時間為4h，固液比為1∶20，提取率為6．23%。

［1］安徽植物志協(xié)作組．安徽植物志（第1卷）［M］．合肥：安徽科學技術書出版，1985．

［2］李海燕，王立川，唐偉斌．栽培蕨菜與野生蕨菜和常見栽培蔬菜營養(yǎng)成分的對比分析［J］．安徽農業(yè)科學，2008，36（14）：2868-2869．

［3］張莉，陳乃富，吳美．蕨根莖及老嫩葉中黃酮含量的比較［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（11）：43-46．

［4］陳乃富．蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（11）：63-66．

［5］陳乃富，黃新華，季洪武．蕨菜黃酮對小鼠體內丙二醛含量的影響［J］．生物學雜志，2006，23（4）：30-33．

［6］張莉，陳乃富，谷仿麗，等．蕨菜黃酮提取物的免疫調節(jié)作用［J］．中國中醫(yī)藥科技，2009（1）：30-31．

［7］張莉，陳乃富，王晨．敗醬黃酮類化合物的提取條件研究［J］．中國林副特產，2007，03：14-16．

［8］趙國華，陳宗道，李至孝，等．活性多糖的研究進展［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（7）：45-45．

［9］張曉靜，劉會東．植物多糖提取分離及藥理作用的研究進展［J］．時珍國醫(yī)國藥，2003，14（8）：495-496．

［10］馬紅櫻，張德祿，胡春香，等．植物活性多糖的研究進展［J］．西北師范大學學報，2004，40（3）：12-14．

［11］鄔衛(wèi)東，張曉文．硫酸-苯酚法測定枸杞多糖含量［J］．中草藥，2003，（3）：38-39．

［12］陳靖，鄒艷麗，徐成東，等．方稈蕨中多糖含量的測定安徽農業(yè)科學［J］．2012，40（6）：3280-3281．

［13］段文昌，趙海泉，張莉，等．鹽膚木果實多糖提取工藝研究［J］．皖西學院學報，2012，28（5）：6-7．