王 欣，齊曉雪，畢 瑩，倪宏波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

傳染性鼻氣管炎病毒gE基因的表達與免疫原性

王 欣，齊曉雪，畢 瑩，倪宏波*

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

摘要[目的] 對牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)gE基因表位進行原核表達，并對表達產(chǎn)物進行免疫原性鑒定。[方法] 利用PCR擴增出gE基因2段表位(gE-A、gE-B)，并構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET-32a-gE。將其轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌中，IPTG誘導(dǎo)表達。表達的gE重組蛋白經(jīng)親和層析純化后，進行Western blot分析。[結(jié)果]重組表達質(zhì)粒pET-32a-gE經(jīng)過PCR、雙酶切及測序證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。SDS-PAGE結(jié)果表明，gE蛋白在大腸埃希菌中高效表達，表達的重組蛋白相對分子量約52 ku，與預(yù)期蛋白分子量一致。純化后的gE重組蛋白濃度為0.254 mg/mL。免疫印跡結(jié)果表明，純化后的gE重組蛋白能與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明其免疫原性良好。[結(jié)論]成功表達了gE基因表位蛋白，該蛋白具有良好的免疫原性，可作為檢測IBRV的gE抗體的候選抗原。

關(guān)鍵詞牛傳染性鼻氣管炎病毒；gE基因；重組蛋白；免疫原性

牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)可引起牛發(fā)生急性、熱性、接觸性傳染病——牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)[1]，主要癥狀為呼吸道和生殖道感染[2-3]。IBRV 主要的基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因[4]，gE基因所編碼的蛋白雖然在病毒的復(fù)制過程中是非必需的，但其能夠以一種細胞特異性的方式對病毒從感染細胞中的釋放進行影響。gE基因的缺失還可對病毒在感染細胞間的傳播途徑進行干擾，同時gE基因缺失疫苗在臨床實踐中已得到了廣泛應(yīng)用，并取得了良好的免疫效果[5]，因此gE可作為檢測IBRV的候選抗原[6]。筆者通過大腸桿菌表達IBRV 的gE基因2段表位(gE-A和gE-B)，旨在為今后建立其診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細胞、病毒和質(zhì)粒牛腎細胞(MDBK)、IBRV分離株、原核表達載體pET-32a(+)、DH 5α菌種、BL21(DE3)菌種，均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實驗室保存。

1.2血清與抗體牛傳染性鼻氣管炎的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清均購自中國獸藥監(jiān)察所；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗牛IgG，購自德國Sigma公司。

1.3主要試劑和酶Trizol Reagent和蛋白純化試劑均購自加拿大MBI Fermentas公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶，均購自四季青生物工程材料有限公司(杭州)；BamH I和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA快速提取劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒，均購自北京博凌科為生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自西諾遠大科技有限公司(北京)；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker和預(yù)染低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker，均購自賽默飛世爾(Thermo Scientific)科技有限公司。

1.4引物的設(shè)計與合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的BHV-1 gE蛋白的基因序列，利用DNAStar和Prime 5.0設(shè)計2對引物，并在引物的 5′端加入相應(yīng)的酶切位點和保護性堿基，用于擴增gE基因的2個抗原表位，由試劑公司合成。PCR反應(yīng)的引物和產(chǎn)物大小如表1所示。

表1　PCR反應(yīng)的引物和產(chǎn)物大小

1.5PCR 擴增及基因克隆采用上述特異性引物對gE-A和gE-B分別進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為常規(guī)反應(yīng)體系。gE基因PCR擴增反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。將PCR產(chǎn)物分別在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，紫外燈下切割目的條帶，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.6重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建用BamH I和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-gE和原核表達載體pET-32a(+)，連接后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌，通過PCR和限制性內(nèi)切酶酶切進行篩選和鑒定，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.7重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，獲得重組陽性菌，用于蛋白表達。挑取單個陽性菌落在含有Amp+的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600值為0.6 時，加入 IPTG至終濃度為1.0 mmol/L進行誘導(dǎo)。同時設(shè)置表達載體對照組，20 ℃誘導(dǎo)表達后14 h取菌液，12 000 r/min 離心1 min，保存沉淀。PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解后，10 000 r/min 離心20 min，收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳，鑒定目的蛋白是否表達和表達方式。

1.8表達產(chǎn)物的純化、復(fù)性及濃度測定取50 mL經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達的菌液，離心后，棄上清。5 mL PBS懸浮，超聲破碎。用等量結(jié)合緩沖液(Binding buffer)懸浮，過柱前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，與1 mL 50% slurry(即鎳柱中加入等體積Binding buffer)混合后于室溫低速振蕩孵育1 h。用1 mL結(jié)合緩沖液洗滌2次，0.5 mL 洗脫液(Elution buffer)洗脫，分管收集洗脫液，即得純化蛋白。純化蛋白以12 000 r/min離心1 min后取上清，加入截留相對分子量為8 000～14 000的透析袋中，于4 ℃下以PBS流動緩沖液透析12 h，每隔2 h換1次緩沖液。進行脫鹽復(fù)性。吸取出透析袋中蛋白以12 000 r/min離心1 min，取上清用超濾法濃縮，于-80 ℃下凍存。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.9Western blot 檢測 將純化后的gE蛋白樣品經(jīng)處理后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%的脫脂奶粉在37 ℃水平搖床上封閉2 h；用5%的脫脂乳對一抗所用的IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按1∶300倍進行稀釋，于37 ℃水平搖床上作用1 h；酶標(biāo)二抗兔抗牛IgG用5%的脫脂乳以1∶5 000倍稀釋，37 ℃水平搖床上作用1 h；用DAB顯色觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1gE基因的PCR擴增結(jié)果PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在約129和372 bp處可見明顯的基因片段，與預(yù)期大小相符(圖1)。

注：1.DNA Marker；2.gE-A表位擴增結(jié)果；3.gE-B表位擴增結(jié)果；4.陰性對照。Note: 1. DNA Marker; 2. Amplification result of gE-A epitope; 3. Amplification result of gE-B; 4. Negative control. 圖1　RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1　Amplification result of RT-PCR

2.2重組原核表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定構(gòu)建的pET-32a-gE重組表達載體經(jīng)BamH I/Hind Ⅲ 雙酶切可以切出約501 bp的目的片段(圖2)。

注：1.DL 10 000 DNA Marker；2.pET-28a-gE 酶切產(chǎn)物。Note: 1. DL 10 000 DNA Marker; 2. pET-28a-gE enzyme-digested products.圖2　重組表達載體的酶切鑒定Fig.2　Enzyme identification of recombinant plasmid

2.3gE重組蛋白的SDS-PAGE檢測將誘導(dǎo)的重組菌和空載體進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明誘導(dǎo)的重組菌有特異性條帶，其分子量為52 ku，與預(yù)期蛋白分子量相符，而誘導(dǎo)的空載體卻沒有該特異性條帶，且主要以可溶性蛋白的形式表達(圖3)。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；2.gE未誘導(dǎo)；3.gE超聲前全菌體；4.gE超聲后上清;5.gE超聲后沉淀。Note: 1. Protein Marker; 2. non-induced gE; 3. Whole cell before gE ultrasound; 4. Supernatant after gE ultrasound; 5. Precipitation after gE ultrasound. 圖3　pET-32a-gE誘導(dǎo)表達Fig.3　Induction expression of pET-328a-gE

2.4gE重組蛋白的純化將可溶性蛋白過Ni柱純化后，可見目的條帶明顯。蛋白濃度采用BCA法測定，純化后的gE重組蛋白濃度為0.254 mg/mL(圖4)。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；2.純化后的gE重組蛋白。Note: 1. Protein Marker; 2. gE recombinant protein after purification. 圖4　純化后的gE重組蛋白檢測Fig.4　The detection of gE recombinant protein after purification

2.5gE重組蛋白的Western blot檢測將純化后的gE蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，進行Western blot 分析檢測，結(jié)果表明表達的融合蛋白在52 ku處出現(xiàn)陽性條帶，且所表達的蛋白具有良好的免疫學(xué)活性，由此判定所表達的蛋白為gE融合蛋白(圖5)。

注：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白預(yù)染Marker；2.純化的gE重組蛋白。Note: 1. Protein Marker; 2. gE recombinant protein after purification. 圖5　純化的gE蛋白的Western blot檢測Fig.5　Western blot analysis of the purified recombinant gE protein

3討論

利用分子生物學(xué)軟件對gE全基因及其編碼的氨基酸進行分析，通過分析目的基因的酶切位點和預(yù)測目的蛋白的跨膜區(qū)、信號肽序列及抗原表位等分子生物學(xué)特性，在參考相關(guān)文獻[7]的基礎(chǔ)上，選取抗原決定簇較集中且具有良好的抗原性和親水性的基因序列。在gE基因上隨機選取2段線性表位，應(yīng)用引物設(shè)計軟件設(shè)計了2對特異性引物，成功擴增出2段目的片段。

擴增出IBR gE部分抗原表位基因，并將其定向克隆到原核表達載體上，并成功表達，經(jīng)親和層析柱純化后，得到了具有良好抗原性且純度較高的gE融合蛋白；Western blot檢測結(jié)果表明，重組的融合蛋白與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能夠發(fā)生特異性反應(yīng)，說明得到的重組蛋白具有良好的抗原性，能夠作為IBRV檢測的優(yōu)勢抗原使用[8]，為牛傳染性鼻氣管炎的檢測和防疫提供了便利的條件，同時也為針對該病的診斷試劑盒的研制提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4結(jié)論

該研究克隆了IBRV的gE部分抗原表位基因，并在大腸桿菌中成功表達，經(jīng)Western blot檢測證實該蛋白具有良好的免疫原性。

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Expression and Immunogenicity of GenegEof Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus

WANG Xin, QI Xiao-xue, BI Ying, NI Hong-bo*

(College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319)

Abstract[Objective] To express gene gE of infectious bovine rhinotracheitis virus, and to identify the immunogenicity of expression products. [Method] Two epitopes (gE-A, gE-B) of gene gE were amplified by PCR amplification. Prokaryotic expression recombinant plasmid pET-32a-gE was constructed, and transformed to BL21(DE3)expression fungus. After induced by IPTG, the expressed recombinant protein gE was purified by nickel ion affinity chromatography and analyzed by Western blot. [Result] The recombinant plasmid was confirmed by PCR, restriction analysis and sequencing. SDS-PAGE showed that gene gE showed high-level expression in Escherichia coli, with the relative molecular weight of expressed recombinant protein being about 52 ku, which was consistent with the predicted molecular weight. The concentration of the purified recombinant protein was 0.254 mg/mL for gE. The fusion protein specifically reacted with IBRV polyclonal antibody from mice, indicating good immunogenicity. [Conclusion] Gene gE epitope protein is successfully expressed. This protein has good immunogenicity and can be used as the candidate antigen for prevention of IBR.

Key wordsIBRV; gE gene; Recombination protein; Immunogenicity

基金項目黑龍江省農(nóng)墾總局“十二五”重點科技攻關(guān)項目(HNK125B-11-10A，HNK125B-11-02)。

作者簡介王欣(1972- )，女，黑龍江密山人，講師，碩士，從事微生物學(xué)方面的研究。*通訊作者，教授，博士，從事動物病原學(xué)與免疫學(xué)研究。

收稿日期2016-03-25

中圖分類號S 852.6

文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-126-03