摘要：目的 構(gòu)建含PRDX5基因啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒。方法 ①通過生物信息學(xué)方法，查詢PRDX5基因啟動子核酸序列；②使用PCR擴增人PRDX5基因啟動子片段，將啟動子插入到pGL3-Basic載體中，構(gòu)建含PRDX5基因啟動子片段的熒光素酶報告質(zhì)粒；③雙酶切及測序確定PRDX5基因啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒擴增正確。結(jié)果 PCR擴增的PRDX5啟動子片段插入到載體中，經(jīng)測序證實正確。結(jié)論 成功構(gòu)建含PRDX5啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒。

關(guān)鍵詞：PRDX5；啟動子；熒光素酶報告基因

Construction of Luciferase Reporter Plasmid PRDX5 Gene Promoter

HU Le-lin

(School of Medicine，The Anhui University of Science and Technology，Huainan 232001，Anhui，China)

Abstract：ObjectiveTo construct a pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid and to vertifying its luciferase activity. Methods①search the nucleic acid sequence of the promoter PRDX5 by bioinformatics analysis.②Methods of PCR was performed to amplify the promoter PRDX5. the promoter PRDX5 was inserted into pGL3-Basic cloning vector to construct luciferase reporter plasmid with the promoter PRDX5.③pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was verified by double-enzyme cleavage and sequencing method.ResultspGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was identified to be correct by double-enzyme cleavage and sequencing method.Conclusion A pGL3-PRDX5-promoter-Luc plasmid was successfully constructed.

Key words：PRDX5;Promoter;Luciferase reporter plasmid;Reactive oxygen species

PRDX5是Peroxiredoxins（PRDXs）過氧化物酶家族蛋白的一種，研究顯示在它廣泛表達(dá)于哺乳動物的各種細(xì)胞，定位于細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體和線粒體中，但在許多細(xì)胞中PRDX5主要定位于線粒體，它與組織過氧化物、過氧化亞硝基陰離子有高的親和力[1]。Masaki shiota[2]等人發(fā)現(xiàn)在外源過氧化氫處理或組織缺氧情況下人類前列腺癌PC3細(xì)胞PRDX5表達(dá)增高。研究還顯示人類定位于線粒體的PRDX5能保護線粒體DNA免受過氧化氫的損傷。并且PRDX5能夠抑制p53誘導(dǎo)的活性氧簇的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡[3]。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞系大腸桿菌tans-5α購自Trans-Gene（全式金）公司；載體質(zhì)粒pGL3-Basic，由本室保存。

1.1.2 DNA 重組所用工具酶及試劑BglII、MluI 等限制性內(nèi)切酶，Taq DNA Polymerase，T4 DNA Ligase購自New England Lab和Promega 公司。大提質(zhì)粒試劑盒購自威格拉斯儀器有限公司。其它常規(guī)試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1用PCR和酶切的方法得到目的片段利用DNA提取試劑盒在U2OS細(xì)胞中提取全基因組細(xì)胞作為模板，根據(jù)已知PRDX5cDNA序列，由生物信息學(xué)方法自UCSC數(shù)據(jù)庫分析其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點，選擇TSS上游約1200bp下游約200bp范圍作為其可能的啟動子序列進行引物設(shè)計。預(yù)計擴增片段長度為1400bp。我們使用軟件DNAMAN分析其上可能存在的限制性內(nèi)切酶位點，結(jié)合載體質(zhì)粒pGL3-Basic上的限制性內(nèi)切酶位點，選擇分別在上、下游引物末端，添加BglII、MluI限制性內(nèi)切酶位點序列。見表1。

1.2.2目的片段與相應(yīng)載體的連接將擴增好的目的片段和PGL3-basic-Luc進行同樣的雙酶切鑒定，回收酶切產(chǎn)物，并進行質(zhì)粒連接反應(yīng)。在10μl的反應(yīng)體系中加入載體、插入片段、T4DNA ligase、T4DNA ligase buffer。載體與插入片段的摩爾數(shù)之比控制在1：3，且二者的總量控制在300ng~500ng之間，置于4℃冰箱連接16h。目的片段和PGL3-basic-Luc通過BglII、MluI酶切位點連接重組質(zhì)粒PGL3-PRDX5-promoter-Luc。

1.2.3篩選陽性質(zhì)粒并測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒送至公司測序確定。

2結(jié)果

2.1生物信息學(xué)方法預(yù)測PRDX5啟動子序列根據(jù)已知的PRDX5 cDNA序列，在UCSC Genome Bioinformatics（http://genome.ucsc.edu/）數(shù)據(jù)庫中，預(yù)測其可能的轉(zhuǎn)錄起始位點。根據(jù)預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點，將其上游約1200bp下游約200bp范圍作為可能的啟動子序列。

2.2 PCR方法擴增預(yù)測序列根據(jù)預(yù)測啟動子的序列設(shè)計引物，利用DNA提取試劑盒在U2OS細(xì)胞中提取全基因組細(xì)胞作為模板，用PCR試劑盒擴增出約1.4kb的目的條帶。見圖1。

圖1PCR擴增PRDX5promoter結(jié)果

2.3構(gòu)建pGL3-PRDX5-promoter-Luc熒光素酶報告基因質(zhì)粒將擴增好的目的片段和PGL3-basic-Luc進行同樣的雙酶切鑒定，回收酶切產(chǎn)物，并進行質(zhì)粒連接反應(yīng)。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，接種在帶氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基中，37℃孵育過夜后。挑出陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。圖2為0.8%的瓊脂糖凝膠結(jié)果，可看出在相應(yīng)的大小條帶上出現(xiàn)陽性結(jié)果。

圖2PRDX5啟動子片段連接入熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Basic酶切鑒定。挑選的克隆擴增后所提質(zhì)粒進行KpnI、NheI限制性內(nèi)切酶雙酶切。

2.4篩選陽性質(zhì)粒并測序?qū)⑦B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒送至公司測序確定。

3討論

PRDX5是Peroxiredoxins過氧化物酶家族蛋白的一種，但在許多細(xì)胞中PRDX5主要定位于線粒體。在氧化應(yīng)激情況下PRDXs家族蛋白能將H2O2轉(zhuǎn)化為水，清除ROS，抵抗ROS對細(xì)胞的損害[4]。Yuan Zhou等在哺乳動物細(xì)胞中首次證實PRDX5能發(fā)揮抗氧化劑功能，抑制p53誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)ROS。PRDX5的晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，與PRDXs家族的其它成員相比，PRDX5具有更強的清除ROS的能力。大量研究顯示活性氧簇水平與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因此可以推測PRDX5可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。如果PRDX5與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，那么研究PRDX5的轉(zhuǎn)錄激活將是很有意義的。在本研究中，我們克隆出PRDX5的啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒，并檢測了其活性。

參考文獻：

[1]Banmeyer I， Marchand C， Verhaeghe C， et al. Overexpression of human peroxiredoxin 5 in subcellular compartments of Chinese hamster ovary cells: effects on cytotoxicity and DNA damage caused by peroxides[J]. Free Radic Biol Med，2004，36(1):65-77.

[2]Shiota M， Izumi H， Miyamoto N， et al. Ets regulates peroxiredoxin1 and 5 expressions through their interaction with the high-mobility group protein B1[J]. Cancer Sci，2008，99(10):1950-1959.

[3]Zhou Y， Kok K H， Chun A C， et al. Mouse peroxiredoxin V is a thioredoxin peroxidase that inhibits p53-induced apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2000， 268(3): 921-927.

[4] Dubuisson M， Vander S D， Clippe A， et al. Human peroxiredoxin 5 is a peroxynitrite reductase[J]. FEBS Lett. 2004， 571(1-3): 161-165.

編輯/哈濤