摘要：目的 通過檢測(cè)RVVC陰道局部HBD-2、LL-37的蛋白濃度及基因表達(dá)，探討其與RVVC發(fā)病的關(guān)系。方法 選取我院門診RVVC28例，VVC30例，健康體檢者30例，Elisa法檢測(cè)陰道灌洗液上清HBD-2、LL-37蛋白濃度，熒光定量PCR檢測(cè)灌洗液沉淀脫落細(xì)胞HBD-2、LL-37的mRNA水平。結(jié)果 ①VVC組HBD-2、LL-37的蛋白濃度顯著高于對(duì)照組及RVVC組；RVVC組HBD-2、LL-37的蛋白濃度較對(duì)照組降低。②VVC組HBD-2、LL-37的mRNA水平高于對(duì)照組，RVVC組HBD-2、LL-37的mRNA水平低于對(duì)照組。結(jié)論 HBD-2、LL-37參與陰道局部抗感染的固有免疫過程；HBD-2、LL-37的低表達(dá)可能是RVVC反復(fù)發(fā)作原因之一。

關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病；HBD-2；LL-37; PCR

外陰陰道假絲酵母菌病（vulovaginal candidiasis，VVC）是女性多發(fā)病?？拐婢幍膹V泛使用并沒有使該病發(fā)病率下降，VVC發(fā)病率約占所有外陰陰道炎中的39%，居第一[1]。5%~10%的患者反復(fù)發(fā)作，成為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。╮ecurent vulovaginal candidiasis， RVVC）。研究表明[2]，RVVC發(fā)病與患者陰道局部免疫功能異常有重要相關(guān)性。人防御素2（HBD-2）及抗菌肽LL-37是人固有免疫系統(tǒng)的重要成分。本研究通過測(cè)定RVVC患者局部兩種因子的濃度及基因水平，探討陰道局部固有免疫與RVVC發(fā)病的關(guān)系，為今后其免疫治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料選取2012.6~2013.1河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院婦科門診就診及健康體檢的婦女為研究對(duì)象，分三組。RVVC組28例，VVC組30例，對(duì)照組30例。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠婦女，合并BV、滴蟲，近一個(gè)月使用陰道局部抗真菌藥，血性分泌物。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：VVC：初發(fā)或偶發(fā)，有典型體征，鏡檢見菌絲，真菌培養(yǎng)為假絲酵母菌；RVVC：VVC經(jīng)治療體征消失，真菌學(xué)查陰性后又出現(xiàn)癥狀，1年內(nèi)發(fā)作4次及以上，真菌培養(yǎng)為假絲酵母菌；對(duì)照組為分泌物檢查正常的婦女。

1.2 標(biāo)本收集采集標(biāo)本獲患者知情同意。以3ml生理鹽水沖洗陰道上段及宮頸，后穹窿處抽取灌洗液，3000轉(zhuǎn)/分離心5min。收集于EP管，用于Elisa實(shí)驗(yàn)；沉淀細(xì)胞成分收集于另一EP管，用于提取脫落細(xì)胞總mRNA。標(biāo)本于-20℃凍存。

1.3 試劑及儀器實(shí)驗(yàn)完成于河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。人源HBD-2、人源LL-37 Elisa試劑盒，兩步法熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒均購自廣州綠色醫(yī)藥科技有限公司；RotorGene 3000 PCR儀，ELX800uv酶標(biāo)儀，高速離心機(jī)，Q3000型微量分光光度計(jì)，引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。

1.4 方法

1.4.1 按照Elisa試劑盒說明書操作，標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度做縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)OD值做橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程，計(jì)算標(biāo)本蛋白濃度。

1.4.2 將陰道脫落細(xì)胞成分融化，加入1ml trizol冰上裂解，按說明書提取各標(biāo)本總mRNA。及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為42℃，50 min。cDNA凍存于-80℃冰箱。用PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20μL。反應(yīng)條件：95℃，15 s；59℃，25 s；共45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用分析軟件Rotor-Gene計(jì)算出2-ΔΔCt值即各標(biāo)本mRNA相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，總體分析采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Elisa檢測(cè)HBD-2、LL-37蛋白水平RVVC組的HBD-2、LL-37濃度較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；VVC組的HBD-2、LL-37含量較對(duì)照組均升高（P＜0.05）。以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 HBD-2、LL-37 mRNA水平結(jié)果RVVC組陰道脫落細(xì)胞的HBD-2 mRNA、LL-37 mRNA的水平比正常對(duì)照組均明顯降低（P＜0.01）；而VVC組陰道脫落細(xì)胞的HBD-2 mRNA水平較對(duì)照組升高（P＜0.05），LL-37 mRNA水平較正常對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）。見表2。

3 討論

陰道固有免疫系統(tǒng)是陰道抵抗外界各種病原的第一道防線，陰道粘膜分泌的抗微生物多肽是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分[3]，它是內(nèi)源性、有抗菌活性的陽離子短肽，其主要包括防御素家族和Cathelicidins家族。而HBD-2和LL-37分別是這兩個(gè)家族的代表多肽。

防御素廣泛存在于口腔、支氣管和生殖道等，已明確其有廣譜、高效抗菌活性。HBD-2除可直接抗白假絲酵母菌外，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子IFN-γ、IL-10從而激活細(xì)胞免疫反應(yīng)。劉朝暉[4]等發(fā)現(xiàn)，白假絲酵母菌接觸體外培養(yǎng)的陰道上皮細(xì)胞后能以時(shí)間依賴的形式刺激其分泌HBD-2，提示陰道上皮細(xì)胞是陰道局部產(chǎn)生HBD-2的重要來源。本研究中，VVC組HBD-2的蛋白濃度和mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，提示了陰道局部分泌HBD-2參與了抑制白假絲酵母菌過度繁殖的過程。而正常對(duì)照組中也檢測(cè)到了HBD-2，推測(cè)是由于假絲酵母菌是條件致病菌，以孢子相少量持續(xù)存在，陰道局部表達(dá)少量HBD-2以維持其正常微生態(tài)環(huán)境。以上結(jié)果表明，VVC發(fā)病時(shí)，HBD-2表達(dá)增強(qiáng)以促進(jìn)對(duì)致病菌的清除。而RVVC組HBD-2的蛋白濃度和mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組及VVC組，可能與RVVC患者陰道局部固有免疫機(jī)制異常有關(guān)，陰道局部合成分泌HBD-2的能力不足。

LL-37的殺菌機(jī)制是通過在真菌表面形成膜離子通道而致其死亡。研究說明，LL-37具有抗白假絲酵母菌的作用。VVC組LL-37的蛋白濃度及mRNA水平均高于對(duì)照組，說明當(dāng)白假絲酵母菌致病時(shí)陰道局部通過分泌LL-37抑制白假絲酵母菌。而RVVC組較對(duì)照組及VVC組的LL-37表達(dá)水平均較低，說明其陰道局部固有免疫的反應(yīng)能力下降，而不足以對(duì)抗白假絲酵母菌的致病，也許是RVVC反復(fù)發(fā)作不愈原因之一。

本研究從蛋白及基因水平檢測(cè)了RVVC及VVC患者HBD-2及LL-37的水平。發(fā)現(xiàn)當(dāng)白假絲酵母菌大量侵襲陰道粘膜時(shí)，能夠誘導(dǎo)陰道局部HBD-2、LL-37高表達(dá)，從而起到抑制其侵襲的作用，可見HBD-2、LL-37參與了陰道局部的固有免疫反應(yīng)；而RVVC組的低表達(dá)表明其陰道局部固有免疫機(jī)制異常，抵抗白假絲酵母菌的能力降低，這可能是其反復(fù)發(fā)作的原因之一。由VVC患者HBD-2、LL-37的高表達(dá)及RVVC患者HBD-2、LL-37的低表達(dá)可以推測(cè)，VVC的發(fā)病機(jī)制與RVVC可能不同，VVC的發(fā)病主要與陰道微環(huán)境失調(diào)有關(guān)，而RVVC發(fā)病主要與陰道局部免疫力低下有關(guān)。這提示我們，采用常規(guī)治療RVVC較VVC治愈率低和感染者陰道局部固有免疫力低下有密切關(guān)系，在抗真菌治療RVVC同時(shí)如能提高感染者局部免疫力，有望能提高RVVC的治愈率。

參考文獻(xiàn)：

[1]石一復(fù). 外陰陰道疾病[M]. 人民衛(wèi)生出版社， 2005.

[2]張岱，劉朝暉，廖秦平.下生殖道感染患者陰道局部免疫狀態(tài)的研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志， 2009.

[3] 鄧敏端，黃英源.復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病患者陰道局部細(xì)胞免疫功能[J].中國婦幼保健， 2010.

[4]劉朝暉，陳磊.陰道上皮細(xì)胞先天性抗假絲酵母菌的作用研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)， 2008.編輯/許言