摘要：目的建立較為簡便的新生大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)方法并建立糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型。方法取新生的大鼠（24 h）大腦皮層組織，消化后種植在多聚-L-賴氨酸包被的六孔培養(yǎng)皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液種植，4~8 h后換再用含有B27的Neurobasal培養(yǎng)基維持飼養(yǎng)。于不同時間點在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化，用免疫組化方法對神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NSE染色鑒定。選取培養(yǎng)第7 d的神經(jīng)元隨機分為不作處理的對照組和過糖-氧剝奪建立細(xì)胞損傷模型組，Western blotting檢測NSE蛋白表達(dá)。結(jié)果2~8 h神經(jīng)元細(xì)胞貼壁，隨著時間的延長，形態(tài)呈多變，突起逐漸增多，神經(jīng)元突起間相互接觸形成網(wǎng)絡(luò)，培養(yǎng)7~10 d時神經(jīng)元胞體最為豐滿，通過免疫組化驗證證明所分離培養(yǎng)的是神經(jīng)元細(xì)胞。糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型組NSE蛋白表達(dá)量較對照組NSE蛋白表達(dá)量明顯降低。結(jié)論該神經(jīng)元方法簡單易行，神經(jīng)元純度較高，并成功的建立糖-氧剝奪神經(jīng)元損傷模型。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；neurobasal培養(yǎng)基；B27；糖-氧剝奪；細(xì)胞模型

神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是一種常用的技術(shù)，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞模型[1]，可為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)病機制和神經(jīng)保護性藥物的篩選提供良好的平臺。在以往關(guān)于缺血/缺氧腦損傷的研究中，主要集中在動物體內(nèi)研究，雖然在體試驗更接近動物的實際狀態(tài)，但易受到其他因素影響。體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，可以得到比較均一的細(xì)胞，可根據(jù)實驗要求控制神經(jīng)元細(xì)胞的生成，有利于動態(tài)觀察神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，從而避免了體內(nèi)研究的許多復(fù)雜因素的影響[2]。

1資料與方法

1.1一般資料 出生后新24 h內(nèi)的SD大鼠，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心； Neurobasal培養(yǎng)液、B27培養(yǎng)基添加劑、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培養(yǎng)基（Hyclone）；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體（abcam公司）；多聚-L-賴氨酸、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。無血清培養(yǎng)基： Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27培養(yǎng)基添加劑(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 雙抗(100U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，于冰箱4℃保存?zhèn)溆?；多?L-氨酸包被液：用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液，0.22 μm濾器過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1大鼠皮層神經(jīng)元的分離和培養(yǎng) 取24 h內(nèi)新生的SD大鼠，采用頸椎脫臼處死小鼠后，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒1～2 min。在無菌的環(huán)境下用剪刀迅速斷頭，用預(yù)冷的PBS液中漂洗干凈移入另一個裝有預(yù)冷H-DEME的容器內(nèi)，充分暴露大腦皮層，在顯微鏡下剝盡皮層的腦膜及血管，將皮層組織剪成碎組織塊，向剪碎的組織中加入濃度為0.05%的胰酶在37°C下進(jìn)行消化，15 min后 終止消化作用。使用1 mL進(jìn)口槍頭對組織進(jìn)行反復(fù)吹打（10次），注意動作要輕柔，且不可產(chǎn)生氣泡。 將吹打后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml的離心管中于4°C離心 1000 rpm，5 min，使用配制好的培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行重懸。200目篩網(wǎng)過濾，以1×106個細(xì)胞/mL，接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)液2 mL，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4~8 h后用neurbasal+B27培養(yǎng)液換全液1次，以后每隔3 d半量換液1次。培養(yǎng)，4~8 h后用neurbasal+B27培養(yǎng)液換全液1次，以后每隔3 d半量換液1次。

1.2.2大鼠皮層神經(jīng)元鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)方法驗證神經(jīng)元細(xì)胞的特異性和純度皮層神經(jīng)元培養(yǎng)到第7 d時，胞體發(fā)育飽滿，取出爬片，選擇NSE作為皮層神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，按標(biāo)準(zhǔn)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行鑒定，按說明書步驟進(jìn)行，以PBS緩沖液代替I抗作陰性對照。隨機去3個視野計數(shù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并照片。

1.2.3糖-氧剝奪損傷模型的建立 選取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基并用PBS液輕輕沖洗2遍，用95%氮氣和5%二氧化碳?xì)怏w飽和10 min后的無糖培養(yǎng)基造成缺糖環(huán)境，在充滿氮氣的37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育45 min，然后換回原培養(yǎng)液，在37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h。

1.2.4 Western blotting檢測神經(jīng)元細(xì)胞的NSE蛋白表達(dá)水平 分別提取對照組和糖-氧剝奪組神經(jīng)元蛋白提取，煮沸變性，電泳2 h，封-閉1~2 h，加一抗NSE (1∶500)、4℃過夜，加HRP標(biāo)記抗兔二抗孵育1~2 h（1∶30000），曝光rad凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)方法 運用SigmaStat 3.5統(tǒng)計軟件，進(jìn)行單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)用表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 SD大鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察，剛種植的皮層神經(jīng)元呈圓形、體積小、透亮、單個散在分布，見表1。2 h后開始有貼壁，8 h后大部分已貼壁。3~4 d細(xì)胞已有明顯的增長的突起，以多級神經(jīng)元為主，胞體為三角形、梭形、橢圓形、椎體形幾不規(guī)則形。5~6 d后神經(jīng)元細(xì)胞體進(jìn)一步變大，突起增粗，連接形成網(wǎng)絡(luò)。7~8 d時，細(xì)胞體積繼續(xù)增大，胞體飽滿，突起分支增大，形成致密網(wǎng)絡(luò)。14 d細(xì)胞數(shù)量開始減少。經(jīng)過氧-糖剝奪后的細(xì)胞從形態(tài)學(xué)觀察貼壁能力下降，細(xì)胞間隙增大，遮光性降低，少數(shù)細(xì)胞壞死。

圖1 體外培養(yǎng)不同時間大鼠皮層神經(jīng)元形態(tài)觀察

2.2免疫組化染色的觀察結(jié)果，見圖2 取第7 d的神經(jīng)元細(xì)胞，NSE免疫組化染色（DBA顯色），胞漿和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的為陽性細(xì)胞，整個細(xì)胞都不被染色為陰性細(xì)胞，見圖3C。在顯微鏡下進(jìn)行觀察，以3個視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細(xì)胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度為90%左右。

2.3 Western blotting測定對照組和糖氧剝奪損傷組中細(xì)胞NSE和β-actin表達(dá)（圖3）糖-氧剝奪細(xì)胞損傷模型組NSE蛋白表達(dá)量較對照組NSE蛋白表達(dá)量明顯降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 皮層神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫組化染色（×400）

圖3 各組中NSE蛋白的表達(dá)（*與對照組比較P<0.05）

3討論

體外培養(yǎng)神經(jīng)元是較困難的原代培養(yǎng)技術(shù)，為成功培養(yǎng)出神經(jīng)元，首先應(yīng)選用新生（24 h內(nèi)）大鼠，因為剛剛出生的大鼠的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均為分化成熟，可較容易養(yǎng)活。其次是組織塊的消化、分離和接種的過程。必須嚴(yán)格控制胰酶的濃度和消化時間，可采用胰酶低濃度，延長消化時間來達(dá)到消化均一的效果，盡可能的減少機械損傷。再次是培養(yǎng)基的選擇。血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)很不均一，從正常到凋亡都有，嚴(yán)重影響試驗準(zhǔn)確，而無血清專用培養(yǎng)基所有的正常細(xì)胞都處于一樣的狀態(tài)，要么都好，要么都差，高度一致。無血清培養(yǎng)基neurobasal是較好的培養(yǎng)基。需要的添加劑為 B27，培養(yǎng)出的細(xì)胞狀態(tài)均一，膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不分裂。

在體外培養(yǎng)神經(jīng)元基礎(chǔ)上氧-糖剝奪模型是模擬在體缺血模型，又稱\"離體缺血模型，大致可分為：化學(xué)缺血模型和氧-糖剝奪模型。化學(xué)模型如氰化物可抑制養(yǎng)花磷酸化，從而阻斷了ATP的產(chǎn)生。氧-糖剝奪模型采用去氧處理過的無糖培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，再放入缺氧箱，使細(xì)胞處于缺氧、缺糖狀態(tài)。細(xì)胞缺氧比較均一。離體細(xì)胞模型的實驗條件容易控制、恒定，卻可以在損傷過程中評價細(xì)胞功能，離體藥物評價和篩選可直接作用細(xì)胞。本課題組采用用95%氮氣和5%二氧化碳?xì)怏w飽和10 min后的無糖培養(yǎng)基造成缺糖環(huán)境，在充滿氮氣的37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育45 min，然后換回原培養(yǎng)液，在37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6 h，造成一根缺血再灌注損傷模型。經(jīng)過氧-糖剝奪后的細(xì)胞從形態(tài)學(xué)觀察貼壁能力下降，細(xì)胞間隙增大，遮光性降低，少數(shù)細(xì)胞壞死，并通過Western blotting檢測NSE蛋白表達(dá)。NSE主要存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)分泌細(xì)胞中。在缺血/缺氧致神經(jīng)元細(xì)胞損傷中，干擾了神經(jīng)元的代謝變化，神經(jīng)元細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)受損，NSE從胞漿中釋放至細(xì)胞外，則細(xì)胞中NSE含量下降，NSE的含量可敏感的反應(yīng)神經(jīng)元損傷程度。在對照組和模型組中NSE蛋白表達(dá)的差異比較，氧-糖剝奪模型組NSE蛋白明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表示達(dá)到了缺血缺氧目標(biāo)，較好的模擬了急性缺血對細(xì)胞的損傷模型。

參考文獻(xiàn)：

[1]喬治·阿德爾曼．神經(jīng)科學(xué)百科全書 [M]．神經(jīng)科學(xué)百科全書翻譯編輯委員譯[M]．上海:伊克豪伊薩爾出版社，上海科學(xué)技術(shù)出版杜，1992:1043-1050．

[2]Mitchell P J， Hanson J C， Quets-Nguyen A T， et al. A quantitative method for analysis of< i> in vitro neurite outgrowth[J]. Journal of neuroscience methods， 2007， 164(2): 350-362.

編輯/張燕