陳萌夢(mèng)，熊興良，李 廣，張婷婷，陳 鎮(zhèn)

（重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究室，重慶 400016）

0 引言

尿微量白蛋白（U-albumin，MAU）是指在尿中出現(xiàn)超出健康人群參考范圍的人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）。正常情況下，絕大部分白蛋白被腎小管重吸收重新進(jìn)入血液，尿液中僅殘存少量的白蛋白。當(dāng)腎小球病變時(shí)，HSA濾過量增多，不能被腎小管全部重吸收而從尿中排出，形成MAU。當(dāng)尿中白蛋白的排泄率1min超過20mg或24 h超過30 mg，尿液白蛋白濃度為30～200 mg/L，即形成用常規(guī)方法無法檢出的白蛋白尿。MAU是診斷早期或輕微腎臟損害的敏感指標(biāo)，也是高血壓患者發(fā)生心腦血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［1］。目前，測(cè)定MAU的方法有很多，如放射免疫法［2］、ELISA 法［3］、高效液相色譜法［4］、免疫透射比濁法［5］等。放射免疫法操作復(fù)雜，存在放射性污染;ELISA法的檢出率較低;高效液相色譜法處理過程復(fù)雜，需要生化儀;免疫透射比濁法作為目前應(yīng)用最普遍的方法，但試劑昂貴，且膽紅素對(duì)檢測(cè)的干擾較大。

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器基于光學(xué)原理，通過入射光與金屬表面的等離子發(fā)生共振，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗原抗體的結(jié)合程度，而且，該傳感器可以根據(jù)其動(dòng)力學(xué)特性繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)生物分子間相互作用的檢測(cè)。這種生化分析技術(shù)具有實(shí)時(shí)、直接、免標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物研究，食品分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等許多領(lǐng)域［6～8］。近來，人們開始應(yīng)用信號(hào)放大技術(shù)提高SPR生物傳感器的靈敏度，其中，納米金（AuNPs）由于具有密度大、介電常數(shù)大、高比表面積等優(yōu)點(diǎn)，極大地增強(qiáng)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度受到越來越多學(xué)者關(guān)注［9］。

本文實(shí)驗(yàn)部分利用河南農(nóng)大研制的SPR傳感器對(duì)MAU的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的儀器是迅捷測(cè)試技術(shù)有限公司HPSPR-6000光學(xué)SPR生物分析儀。試劑包括:HSA，鼠抗HAS單克隆抗體（monoclonal mouse anti-HSA），NHS（N-hydroxysuccinimide，N—羥基琥珀酰亞胺），EDC（1—ethyl—3—（3-dimethy-laminopropyl）carbondiimide hydrochloride，N—乙基—N'—（二甲氨基丙基）碳二甲胺），MUA（11-mercapto-hexadecanoic acid，16—巰基十六醇），納米金（10 nm）均購自 Sigma-Aldrich公司;反應(yīng)的緩沖液為0.1 mol/L PBS，其他試劑為分析純，尿標(biāo)本預(yù)先用生理鹽水30倍稀釋測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗—HSA 的固定

在干凈的SPR芯片表面滴加10 mmol/L MUA，室溫下避光反應(yīng)24 h，使其表面形成一層巰基自組裝單分子層。然后將0.1 mol NHS和0.4 mol/L EDC等體積混合滴于金膜表面反應(yīng)5 h，交聯(lián)活化芯片。隨后取20 μL抗—HSA滴于芯片表面反應(yīng)8 h。最后滴加1 mol/L pH=8.5鹽酸乙醇胺，封閉多余的羧基。每次芯片處理之前都要用:無水乙醇沖洗干凈，并用大量去離子水反復(fù)洗，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法

1）直接檢測(cè):將處理后的芯片裝入 SPR儀內(nèi)，以20 μL/min通入稀釋到不同濃度（0～100 μg/L）的 HSA 溶液，芯片上的抗體與HSA結(jié)合。每次反應(yīng)以后都要通入4%SDS溶液再生。

2）納米金放大檢測(cè):不同濃度（0～100 μg/L）的HSA與納米金混合以后，以20 μL/min通入芯片表面5 min。再生方法同上。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 HSA特異性對(duì)照實(shí)驗(yàn)

由于人尿液含有血紅蛋白、肌酐、膽紅素、尿酸等干擾物質(zhì)會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。本實(shí)驗(yàn)取了2組共100例樣本，實(shí)驗(yàn)組分別是健康組60例（男33例，女27例），均排除高血壓、糖尿病及其他和腎病有關(guān)病史。糖尿病組，40例（男28例，女12例）。健康組和患者組均分別留取隨機(jī)尿，并以不同方法測(cè)定白蛋白。隨后配制與實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)濃度的純的HSA溶液100份作為對(duì)照組，均以直接法通入SPR儀中。數(shù)據(jù)表明:尿液中的干擾物質(zhì)并沒有對(duì)響應(yīng)結(jié)果造成影響，這應(yīng)該與抗體的特異性有關(guān)，證明該法可以用于臨床檢測(cè)。

2.2 2種檢測(cè)法比較

圖1（a）顯示了不同濃度的HSA通入芯片表面所產(chǎn)生的信號(hào)。利用直接檢測(cè)法可以檢測(cè)到0.3 μg/L，而固定更多的抗體，對(duì)于檢測(cè)范圍和檢測(cè)限沒有明顯影響。納米金放大檢測(cè)的動(dòng)態(tài)曲線如圖1（b）所示，檢測(cè)限幾乎可以達(dá)到0.03 μg/L，加入納米金極大地增強(qiáng)傳感器響應(yīng)信號(hào)，最終所得到的總的響應(yīng)值大約是直接檢測(cè)所得到的響應(yīng)值的10倍。分析結(jié)果表明:通過這種加入納米金的方法，可以得到更精確的靈敏度，有效地增強(qiáng)了響應(yīng)信號(hào)，同時(shí)，極大地降低了檢測(cè)限。

圖1 不同濃度HSA響應(yīng)曲線Fig 1 HSA response curve of different concentration

3 結(jié)論

本文提出了一種快速檢測(cè)MAU的生物傳感器的方法，該法處理簡(jiǎn)單，用時(shí)短，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。但是SPR由于儀器費(fèi)用較高，僅在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室投入使用，無法實(shí)現(xiàn)家用便攜式檢測(cè)。由于SPR芯片的特殊性，對(duì)于金膜厚度和樣本固定情況不一，存在一定的誤差，所以，需要操作的專業(yè)性強(qiáng)。目前通過對(duì)各個(gè)因素的控制，芯片之間的差異可以控制在10% 以內(nèi)。SPR儀可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)，將樣本誤差減到最小，重復(fù)使用率也明顯高于其他生物分析儀器。

［1］LHillege H L，F(xiàn)idler V，Diercks G F，et al.Urinary albumin excretion predicts cardiovascular and noncardiovascular mortality in general population［J］.Circulation，2002，106（14）:1777-1782.

［2］LMiles D，Mogensen C，Gundersen H.Radioimmunoassay for urinary albumin using a single antibody［J］.Scandinavian Journal of Clinical＆ Laboratory Investigation，1970，26（1）:5-11.

［3］Feldt-Rasmussen B，Dinesen B，Deckert M.Enzyme immunoassay:An improved determination of urinary albumin in diabetics with incipient nephropathy［J］.Scandinavian Journal of Clinical＆ Laboratory Investigation，1985，45（6）:539-544.

［4］Owen W E，Roberts W L.Performance characteristics of an HPLC assay for urinary albumin［J］.American Journal of Clinical Pathology，2005，124（2）:219-225.

［5］Kearney E，Mount J，Watts G，et al.Simple immunoturbidimetric method for determining urinary albumin at low concentrations using Cobas-Bio centrifugal analyser［J］.Journal of Clinical Pathology，1987，40（4）:465.

［6］Yuan J，Oliver R，Li J，et al.Sensitivity enhancement of sprassay of progesterone based on mixed self-assembled monolayers using nanogold particles［J］.Biosensors and Bioelectronics，2007，23（1）:144-148.

［7］Ruemmele J A，Hall W P，Ruvuna L K，et al.A localized surface plasmon resonance imaging instrument for multiplexed biosensing［J］.Analytical Chemistry，2013，85（9）:4560-4566.

［8］Foudeh A M，Daoud J T，F(xiàn)aucher S P，et al.Sub-femtomole detection of 16s rRNA from legionella pneumophila using surface plasmon resonance imaging［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，52:129-135.

［9］Lyon L A，Musick M D，Smith P C，et al.Surface plasmon resonance of colloidal Au-modified gold films［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，1999，54（1）:118-124.