徐律韻（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院急診科，江蘇南京211102）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率高，總體預(yù)后差。究其原因，主要是由于肝癌具有極高的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。從一定程度上講，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲可以控制或降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[1]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種非受體型酪氨酸激酶，在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)，對(duì)腫瘤的黏附、遷移、侵襲等行為起著重要的調(diào)控作用[2-3]。紫杉醇（paclitaxel）是從紅豆杉屬植物紫杉的樹皮和樹干中提取并開發(fā)利用的天然抗癌藥物，既往研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]，但其他抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究選用人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 作為研究對(duì)象，觀察紫杉醇對(duì)該細(xì)胞的黏附及侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，進(jìn)一步闡明紫杉醇新的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 紫杉醇，購(gòu)自上海華聯(lián)制藥有限公司，使用時(shí)用0.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3 購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），小牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma公司），鼠抗人FAK 抗體、羊抗鼠多克隆二抗（美國(guó)Santa Cruz 公司），Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司），Matrigel 膠、電泳儀（美國(guó)BD 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721 及NIH3T3 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素150 μg/mL 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 體外細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn) 每孔30 μL Matrigel 膠包被96孔板，成膠后加入濃度為5×105mL-1的SMMC-7721 細(xì)胞懸液100 μL。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的紫杉醇，終濃度分別為10、20、40 nmol/L（紫杉醇組），對(duì)照組加入培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL 無血清培養(yǎng)液和5 mg/mL 的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm 處讀取各孔吸光度（OD）值，以O(shè)D值代表黏附細(xì)胞數(shù)。按下列公式計(jì)算細(xì)胞黏附抑制率：抑制率（%）=[1－（加藥孔平均OD 值－空白孔平均OD 值）/（對(duì)照孔平均OD值－空白孔平均OD 值）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]將Transwell 小室4 ℃預(yù)冷，Matrigel 膠冰上融化后每室200 μL 加至Transwell 上室。成膠后分別消化經(jīng)過不同濃度紫杉醇（10、20、40 nmol/L）干預(yù)24 h 后的SMMC-7221 細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升5×104個(gè)，取800 μL 細(xì)胞懸液加于成膠后的Transwell 上室。在Transwell 下室內(nèi)加入經(jīng)饑餓培養(yǎng)24 h 的NIH3T3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液1.2 mL 作為趨化因子，培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去上室中的培養(yǎng)液，用0.9%氯化鈉溶液棉簽輕擦去Matrigel 膠，在倒置顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)量，然后將膜取出，95%乙醇固定10 min，蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡（×200）下任取5 個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿透Matrigel 膠的肝癌細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.4 體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 方法步驟與1.2.3 中體外侵襲力測(cè)定相同，只是侵襲小室的濾膜不用Matrigel 膠覆蓋。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)FAK 蛋白表達(dá) 不同濃度紫杉醇（10、20、40 nmol/L）干預(yù)SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞蛋白樣品。取20 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），隨后以半干電轉(zhuǎn)移恒流轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂牛奶封閉后，加入1∶500 稀釋的鼠抗人FAK 一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入1∶1 000 稀釋的羊抗小鼠-辣根過氧化物酶（HRP）室溫下孵育2 h，反復(fù)洗膜后加入化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液，保鮮膜封膜，暗室壓片曝光，經(jīng)顯影、定影后，惠普掃描儀掃描膠片，存為圖片。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參，用上海復(fù)日公司Smart view 圖像分析處理系統(tǒng)對(duì)Western blot 曝光膠片進(jìn)行灰度掃描，以灰度的高低代表蛋白表達(dá)高低。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 紫杉醇對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞與Matrigel 膠黏附的影響 紫杉醇具有抗SMMC-7721 細(xì)胞與Matrigel 膠黏附的作用，其作用強(qiáng)度隨著藥物濃度的升高而上升，10、20、30 nmol/L 紫杉醇的黏附抑制率分別為：（24.96±6.65）%、（44.85±4.53）%、（63.86±7.72）%，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且各紫杉醇作用濃度之間的黏附抑制率比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度紫杉醇細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 紫杉醇對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 不同濃度紫杉醇干預(yù)SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)分別較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或0.01），提示SMMC-7721 的侵襲及遷移能力均明顯下降，見表1、圖2。

表1 紫杉醇對(duì)SMMC-7721 侵襲和遷移能力的影響（±s，%）

表1 紫杉醇對(duì)SMMC-7721 侵襲和遷移能力的影響（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

組別對(duì)照組紫杉醇組10 nmol/L 20 nmol/L 40 nmol/L侵襲能力 遷移能力80.67±5.76 110.33±9.87 55.33±4.56a 35.67±4.16b 14.00±2.08b 90.67±7.02a 50.67±7.23b 20.67±3.12b

圖2 侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 紫杉醇對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞FAK 蛋白表達(dá)的影響 不同濃度紫杉醇作用于SMMC-7721 細(xì)胞24 h 后，各實(shí)驗(yàn)組FAK 蛋白表達(dá)水平逐漸下降。將對(duì)照組FAK 的表達(dá)率定為100%，10、20、30 nmol/L 的紫杉醇分別作用后，SMMC-7721 細(xì)胞內(nèi)FAK 蛋白的表達(dá)率分別為（76.90±6.04）%、（42.92±3.75）%、（16.67±3.77）%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且各紫杉醇作用濃度間的FAK 表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3；其典型Westen blot 凝膠電脈圖見圖4。

圖3 不同濃度紫杉醇下調(diào)SMMC-7721 細(xì)胞內(nèi)FAK 蛋白的表達(dá)

圖4 Westen blot 條帶圖

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本特征之一，如何阻斷癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)帶瘤生存時(shí)間，是目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一[7]。FAK 在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中均高表達(dá)[8]。Itoh 等[9]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中高表達(dá)的FAK 與肝癌細(xì)胞的黏附、播散、凋亡、遷移、侵襲能力呈正相關(guān)；同時(shí)，F(xiàn)AK 是整合素依賴性信號(hào)傳導(dǎo)通路中的基礎(chǔ)分子，其作為胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺(tái)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的交聯(lián)反應(yīng)， 活化多條信號(hào)傳導(dǎo)通路， 進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性表型和侵襲轉(zhuǎn)移等行為[10]。

紫杉醇類藥物能促進(jìn)微管蛋白裝配成微管，抑制微管的解聚，從而導(dǎo)致微管束排列異常，形成星狀體后使紡錘體失去正常功能，抑制細(xì)胞有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。目前已有較多研究表明，紫杉醇抗腫瘤毒性除與抗微管作用有關(guān)外，還與誘發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]。以往關(guān)于紫杉醇的研究大多集中在其促腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用方面，較少涉及在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究。腫瘤細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟是穿過基底膜，其過程包括：（1）通過細(xì)胞的表面受體黏附到基底膜上；（2）分泌多種酶降解鄰近的基底膜組織；（3）在化學(xué)趨化物的作用下穿透移動(dòng)到目標(biāo)組織。本研究觀察了紫杉醇作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 后對(duì)其侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，并初步探討其可能機(jī)制，利用體外黏附和侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)紫杉醇有抗SMMC-7721 細(xì)胞黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用，同時(shí)，用western blot方法進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，不同濃度紫杉醇干預(yù)SMMC-7721細(xì)胞24 h 后，各組細(xì)胞內(nèi)FAK 的蛋白表達(dá)量均隨藥物濃度的增加而減少，呈劑量依賴性，提示紫杉醇可能通過FAK信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移，而有關(guān)紫杉醇下調(diào)FAK 表達(dá)后，F(xiàn)AK通過何種信號(hào)通路來影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，還有待進(jìn)一步研究。

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