曾 超，李應(yīng)廣，古超云，林翠霞（廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東東莞523808）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于肺癌，位居第2 位[1]。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，不久前召開的第8 屆全國(guó)胃癌學(xué)術(shù)大會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新發(fā)胃癌40萬例，發(fā)病約占全世界的42%，但目前關(guān)于胃癌發(fā)病的具體分子機(jī)制仍不清楚。14-3-3 蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中含量較豐富的蛋白之一。真核細(xì)胞中14-3-3 蛋白通過與相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用，啟動(dòng)細(xì)胞周期并監(jiān)測(cè)DNA 損傷狀態(tài)，并可激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK），從而抑制細(xì)胞凋亡，與整聯(lián)蛋白（integrin）協(xié)調(diào)作用，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。近年來，越來越多的研究證實(shí)，14-3-3 蛋白家族在腫瘤的形成和發(fā)展過程中起著非常重要的作用。14-3-3 蛋白在組織細(xì)胞中含量豐富，由7 個(gè)亞型組成（ε、β、γ、σ、λ、ζ、η），具有高度保守的蛋白序列結(jié)構(gòu)，參與多種重要的細(xì)胞生理過程，包括信號(hào)轉(zhuǎn)換、免疫應(yīng)答、凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)控、調(diào)節(jié)黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等[2]。最新研究表明，14-3-3σ 蛋白被認(rèn)為是這7 個(gè)蛋白亞型中與癌癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最密切的蛋白。目前為止，14-3-3σ 蛋白與胃癌的關(guān)系國(guó)內(nèi)外均很少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法檢測(cè)14-3-3σ蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析14-3-3σ 蛋白表達(dá)與胃癌各臨床參數(shù)的關(guān)系，以期為胃癌的基因治療尋找有效的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇75 例胃癌手術(shù)患者癌組織及相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織，患者年齡30～84 歲，中位年齡65 歲；男50 例，女25 例。胃癌臨床分期Ⅰ期9 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期1 例；腫瘤分化程度，高分化33 例，低、中分化42 例；腫瘤累及淋巴結(jié)48 例，未侵犯淋巴結(jié)27 例。。

1.2 材料與試劑 組織芯片（OD-CT-DgStm01-014）購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司，鼠抗人14-3-3σ 蛋白多克隆抗體（MS-1185）購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；即用型免疫組化超敏鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（SP）試劑盒（KIT-9701）、濃縮型3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑盒均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化SP 法 組織芯片采用微波抗原修復(fù)，單克隆14-3-3σ 蛋白一抗稀釋度1∶100，二抗為生物素標(biāo)記，DAB 顯色，蘇木素對(duì)比染色，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。觀察結(jié)果以胞漿呈棕色顆粒為陽性。實(shí)驗(yàn)步驟按照SP 法實(shí)驗(yàn)試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.2 免疫組化結(jié)果評(píng)判 14-3-3σ 蛋白陽性表達(dá)主要定位于胃癌細(xì)胞胞漿。陽性表達(dá)評(píng)定以腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞比例的乘積決定。腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分按未見著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別判定為0、1、2、3 分；陽性腫瘤細(xì)胞比例評(píng)分如下：陽性細(xì)胞數(shù)小于5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%，分別給予0、1、2、3、4 分。腫瘤細(xì)胞強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分的乘積：＜2 分評(píng)定為陰性（-），≥2 分評(píng)定為陽性（+）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 14-3-3σ 蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá) 組織芯片研究結(jié)果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中表達(dá)主要定位于胞漿，其陽性表達(dá)腫瘤細(xì)胞呈彌散性散在分布，見圖1。統(tǒng)計(jì)學(xué)研究結(jié)果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為88.0%，而在相應(yīng)癌旁組織的陽性表達(dá)率為34.7%，兩組間14-3-3σ 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），見表1。

圖1 組織芯片檢測(cè)胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達(dá)

表1 胃癌組織與癌旁組織中14-3-3σ 蛋白的表達(dá)

2.2 胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期均無顯著相關(guān)性，而與腫瘤大小有密切相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 胃癌組織中14-3-3σ 蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3 蛋白家族主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞凋亡及相關(guān)信號(hào)通路等參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3-6]。Fanger 等[7]發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ 蛋白可結(jié)合在促分裂原細(xì)胞外激酶-Ⅰ（MEKKⅠ）的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的作用，從而抑制細(xì)胞凋亡。14-3-3β 蛋白包含1 個(gè)可與整聯(lián)蛋白β1（integrin β1）相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，它們之間的相互作用促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散和遷移[8]。14-3-3γ 蛋白在人類肺癌細(xì)胞系H322中過表達(dá)可導(dǎo)致異常的DNA 復(fù)制和多倍體化，14-3-3γ 蛋白的過表達(dá)可使細(xì)胞繞過有絲分裂監(jiān)測(cè)點(diǎn)，而促使腫瘤細(xì)胞異常增殖[9]。

目前研究表明，14-3-3σ 蛋白是14-3-3 蛋白家族中與腫瘤關(guān)系最為密切的蛋白。14-3-3σ 蛋白主要受抑癌基因p53 的調(diào)控，而p53 基因的損傷，可以直接影響14-3-3σ 蛋白的表達(dá)水平[10]。Pei等[11]研究表明，14-3-3σ 蛋白在大腸癌中表達(dá)上調(diào)。與此類似的是，Agarwal 等[12]使用免疫染色發(fā)現(xiàn)14-3-3σ 蛋白僅在胰腺癌組織中有表達(dá)，而在正常胰腺組織和慢性胰腺炎組織中無表達(dá)。值得注意的是，Yang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中處于低表達(dá)狀態(tài)。以上研究結(jié)果提示，14-3-3σ 蛋白在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況可能并不一致，14-3-3σ 蛋白在各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中所起的作用也可能不同。

本研究結(jié)果顯示，14-3-3σ 蛋白在胃癌組織與癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為88.0%和34.7%，提示14-3-3σ 蛋白可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。王鳳超等[14]曾經(jīng)報(bào)道，14-3-3σ mRNA 在胃癌中的表達(dá)水平較低，這與本研究結(jié)果有差異。推測(cè)可能是以下2 種原因?qū)е铝诉@種差異。首先，可能是所選取胃癌樣本的差異及樣本總體數(shù)量的差異；其次，王鳳超等[14]是在RNA 水平對(duì)14-3-3σ 基因表達(dá)進(jìn)行研究。眾所周知，蛋白質(zhì)才是決定細(xì)胞生物學(xué)功能的最終產(chǎn)物。而基因的表達(dá)到最終蛋白質(zhì)的形成需要經(jīng)過一系列復(fù)雜過程，例如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。而RNA 的表達(dá)情況僅體現(xiàn)14-3-3σ基因的轉(zhuǎn)錄水平。從RNA 到蛋白質(zhì)還需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯階段。因此，為了深入了解14-3-3σ 基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能起到的重要生物學(xué)作用，本研究主要是集中在蛋白質(zhì)水平對(duì)14-3-3σ 蛋白進(jìn)行探討， 這種研究層次的差別也可能導(dǎo)致得出與王鳳超等[14]研究相異的結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌中的表達(dá)與患者的年齡、性別、病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等均無顯著相關(guān)性，這與王鳳超等[14]在mRNA 水平上的研究結(jié)果一致。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，14-3-3σ 蛋白陽性表達(dá)的差異與腫瘤大小存在顯著相關(guān)性，表明該蛋白的表達(dá)與細(xì)胞增殖或凋亡存在某種聯(lián)系。腫瘤體積的大小是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性，近年來的研究也表明，腫瘤大小可作為胃癌的重要預(yù)后指標(biāo)[15-17]。而14-3-3σ 蛋白與胃癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的相關(guān)性及其可能涉及的具體分子機(jī)制是下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述，14-3-3σ 蛋白的過表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展?？紤]到14-3-3σ 蛋白表達(dá)與腫瘤大小的密切相關(guān)性，推測(cè)其可能與胃癌細(xì)胞的增殖或凋亡存在一定的聯(lián)系。本研究為闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但14-3-3σ 蛋白參與胃癌細(xì)胞增殖或增殖的相關(guān)具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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