趙昕梅+遠凌威
摘 要:通過設(shè)計正交試驗,以HPLC法檢測的綠原酸含量為考察指標,對樣品顆粒大小、提取溶劑、超聲波處理時間和提取次數(shù)進行提取工藝優(yōu)化。結(jié)果為樣品顆粒過60目篩,50%甲醇為溶劑,40 ℃水浴超聲處理20 min時,金銀花中綠原酸提取量最高,為17.015 mg/g,重復(fù)提取2次時綠原酸提取率為95.57%。該方法簡單、快速、準確,可用于金銀花中綠原酸的提取。
關(guān)鍵詞:金銀花 ?綠原酸 ?提取工藝 ?高效液相色譜法
中圖分類號:R282.2 文獻標識碼:A 文章編號:1674-098X(2014)11(b)-0042-02
金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或帶初開的花,具有清熱解毒、平肝明目、和抗菌、降壓等功效[1],其主要活性成分之一綠原酸作為金銀花中酚酸類化合物,具有抗菌、抗炎、抗內(nèi)毒素、抗氧化、降血脂、血糖等多種作用[2-3],在醫(yī)藥、食品和日用化工領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。綠原酸含量被用作評價金銀花質(zhì)量的指標,因此,建立簡單、快速和準確的綠原酸提取工藝成為檢測金銀花質(zhì)量的前提。該文嘗試采用高效液相色譜法測定綠原酸的含量,超聲波輔助法對樣品顆粒大小、超聲波處理時間、提取溶劑和提取次數(shù)等因素進行考查,以確定金銀花中綠原酸的最佳提取工藝,為金銀花質(zhì)量標準的進一步完善提供參考。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀(UltiMate3000,戴安),ULUP-Ⅳ優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普),等。乙腈為色譜純(ThermoFisher),金銀花購自信陽市美銳大藥房。對照品綠原酸(上海同田,批號:327-97-9)。
2 方法與結(jié)果
2.1 供試品制備工藝研究
該文對綠原酸提取過程中的顆粒大小(A),甲醇體積分數(shù)(B),超聲波處理時間(C)和抽提次數(shù)(D)等4個主要因素分別進行了3個水平正交試驗設(shè)計。
由表1極差分析可知,當以綠原酸的提取量為檢測指標時,各因素的影響大小依次為B>D>C>A,即提取溶劑(B)對綠原酸的提取效果影響最為顯著,表現(xiàn)為,水平2>水平3>水平1,為主要因素,應(yīng)取最好水平;樣品提取次數(shù)(D)對綠原酸提取量的影響僅次于提取溶劑,而樣品顆粒大小和超聲波處理時間,為次要因素。然而,由同一因素不同水平下綠原酸的平均提取量k值的大小可知,在A因素中,隨著樣品顆粒的變小,綠原酸提取量在樣品過60目篩時最好;在C因素中,隨著超聲處理時間的增加,綠原酸的提取量呈增加趨勢,而水平1和水平2對未表現(xiàn)出明顯差異;在D因素中,隨提取次數(shù)的增加綠原酸的提取效果表現(xiàn)為水平3>水平2>水平1,而水平2和水平3差異不大。因此,考慮到操作時間和成本等原因,各因素的最佳搭配為A2B2C3D2。此方案與正交表中的序號為5的條件比較接近,通過補做試驗得到綠原酸的平均提取量為17.015 mg/g(表2),比方案5中綠原酸提取量(14.892 mg/g)提高了14.26%,這說明方案A2B2C3D2可作為金銀花中綠原酸提取工藝的理想選擇。
綜合正交試驗驗和補做的單因素試驗結(jié)果,金銀花中綠原酸的最佳提取方案為:樣品干燥后研磨成顆粒(60目)1.0 g,加入20 mL 50%甲醇溶液,40 ℃水浴超聲處理20 min,然后10,000 r/min離心5 min,分離液體和組織塊,將液體轉(zhuǎn)移至新的容器中;再用20 mL 50%甲醇溶液懸浮組織塊,40 ℃水浴超聲處理10 min,合并液體部分;利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將合并的液體濃縮,定容10 mL 50%甲醇溶液中,待用。
2.2 色譜條件
該文中所有色譜試驗均采用高效液相色譜DIONEX UltiMate?? 3000 (Thermo Scientific,U.S.)系統(tǒng)進行。數(shù)據(jù)分析采用變色龍分析軟件(revision 6.8, Thermo Scientific,U.S.)。色譜柱:C18柱(Acclaim,250 mm×4.6 mm, 5 μm, Thermo Scientific,U.S.);流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液(12:88);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為310 nm;進樣量為20 ?L。
2.3 對照品溶液的制備
取綠原酸對照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,加入50%甲醇溶液并定容至50 mL,搖勻并進行超聲處理,待藥品完全溶解后即得200 ?g/mL的綠原酸對照品儲備液,放入冰箱(4 ℃)待用。
2.4 標準曲線的繪制
將5個濃度梯度的對照品溶液(100、50、25、12.5、6.25 ?g/mL),按上述色譜條件進行檢測,變色龍軟件自動以峰面積為縱坐標,綠原酸檢測濃度(?g/mL)為橫坐標,繪制標準曲線并進行回歸計算,回歸方程為:Y=0.7495X-1.0041,R2=0.9996,結(jié)果表明綠原酸在6.25~100 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5 精密度試驗
取綠原酸對照品溶液(50 ?g/mL),連續(xù)進樣6次,按“2.2”項下色譜條件測定,結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.21%。
2.6 重復(fù)性試驗
取同一批金銀花粉末6份,依照優(yōu)化后的方案進行處理,并計算綠原酸的含量。結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.73%。
2.7 穩(wěn)定性試驗
取同一供試品溶液,分別于樣品制備后0、3、6、9、12 h進行測定,結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.49%,結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。
2.8 加樣回收率試驗
準確稱取金銀花粉末0.2 g,共12份,其中6份分別加入綠原酸對照品200 ?g,再按優(yōu)化方案制備供試品溶液,經(jīng)HPLC測得綠原酸的平均回收率為100.75%,RSD為1.62%,結(jié)果表明該方法準確。endprint
2.9 樣品測定結(jié)果
精確稱取0.2 g金銀花樣品,共9份,每種提取液3個重復(fù),并按照最佳提取條件對其中的綠原酸進行提取。由HPLC檢測結(jié)果(表2)可以看出,在第一次提取液中,熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中,甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g,顯著高于熱水中綠原酸提取量(0.756 mg/g)和50%甲醇中綠原酸提取量(0.907 mg/g);而第三次提取液中,3種提取液中的綠原酸含量都比較低??傊?,50%甲醇作為提取溶劑時,綠原酸提取量最高,平均為17.015 mg/g,甲醇次之,為14.815 mg/g。
3 結(jié)語
本研究得出體積分數(shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時,綠原酸提取量顯著高于熱水,而且非目標物質(zhì)的峰面積較小,有利于綠原酸的進一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時獲得95%以上的綠原酸,因此,為了減少提取液濃縮過程中的能耗和提高工作效率,可以只選擇2次提取操作。
樣品顆粒大小和超聲波處理時間直接影響到物質(zhì)的溶出效果,但是顆粒過小則會增加樣品的處理難度,綠原酸得率與超聲波處理時間關(guān)系不顯著,反而延長處理時間會增大提取溶液粘度,尤其是熱水作為提取溶劑時。
總之,金銀花樣品干燥至恒重后,研磨,顆粒過60目篩,50%甲醇為溶劑,40 ℃水浴超聲處理20 min時,綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡便、快速、準確,可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。
參考文獻
[1] 中國藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:295.
[2] 雷玲,李興平,白筱璐,等.金銀花抗內(nèi)毒素、解熱、抗炎作用研究[J].中藥藥理與臨床,2012,28(1):115-117.
[3] Hebeda CB,Bolonheis SM,Nakasato A,et al.Effects of chlorogenic acid on neutrophil locomotion functions in response to inflammatory stimulus[J].J Ethnopharmacology,2011,135(2): 261-269.endprint
2.9 樣品測定結(jié)果
精確稱取0.2 g金銀花樣品,共9份,每種提取液3個重復(fù),并按照最佳提取條件對其中的綠原酸進行提取。由HPLC檢測結(jié)果(表2)可以看出,在第一次提取液中,熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中,甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g,顯著高于熱水中綠原酸提取量(0.756 mg/g)和50%甲醇中綠原酸提取量(0.907 mg/g);而第三次提取液中,3種提取液中的綠原酸含量都比較低??傊?,50%甲醇作為提取溶劑時,綠原酸提取量最高,平均為17.015 mg/g,甲醇次之,為14.815 mg/g。
3 結(jié)語
本研究得出體積分數(shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時,綠原酸提取量顯著高于熱水,而且非目標物質(zhì)的峰面積較小,有利于綠原酸的進一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時獲得95%以上的綠原酸,因此,為了減少提取液濃縮過程中的能耗和提高工作效率,可以只選擇2次提取操作。
樣品顆粒大小和超聲波處理時間直接影響到物質(zhì)的溶出效果,但是顆粒過小則會增加樣品的處理難度,綠原酸得率與超聲波處理時間關(guān)系不顯著,反而延長處理時間會增大提取溶液粘度,尤其是熱水作為提取溶劑時。
總之,金銀花樣品干燥至恒重后,研磨,顆粒過60目篩,50%甲醇為溶劑,40 ℃水浴超聲處理20 min時,綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡便、快速、準確,可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。
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2.9 樣品測定結(jié)果
精確稱取0.2 g金銀花樣品,共9份,每種提取液3個重復(fù),并按照最佳提取條件對其中的綠原酸進行提取。由HPLC檢測結(jié)果(表2)可以看出,在第一次提取液中,熱水中綠原酸的提取量分別僅為甲醇提取液中的25.28%和為50%甲醇提取液中的32.61%;在第二次提取液中,甲醇中綠原酸提取量為2.290 mg/g,顯著高于熱水中綠原酸提取量(0.756 mg/g)和50%甲醇中綠原酸提取量(0.907 mg/g);而第三次提取液中,3種提取液中的綠原酸含量都比較低??傊?,50%甲醇作為提取溶劑時,綠原酸提取量最高,平均為17.015 mg/g,甲醇次之,為14.815 mg/g。
3 結(jié)語
本研究得出體積分數(shù)為50%的甲醇溶液作為金銀花中綠原酸的提取溶劑時,綠原酸提取量顯著高于熱水,而且非目標物質(zhì)的峰面積較小,有利于綠原酸的進一步純化。3種提取溶劑均可在完成2次抽提時獲得95%以上的綠原酸,因此,為了減少提取液濃縮過程中的能耗和提高工作效率,可以只選擇2次提取操作。
樣品顆粒大小和超聲波處理時間直接影響到物質(zhì)的溶出效果,但是顆粒過小則會增加樣品的處理難度,綠原酸得率與超聲波處理時間關(guān)系不顯著,反而延長處理時間會增大提取溶液粘度,尤其是熱水作為提取溶劑時。
總之,金銀花樣品干燥至恒重后,研磨,顆粒過60目篩,50%甲醇為溶劑,40 ℃水浴超聲處理20 min時,綠原酸得率高、重復(fù)性好。本提取工藝操作簡便、快速、準確,可以為金銀花質(zhì)量監(jiān)控提供一定的技術(shù)支持。
參考文獻
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