賈丹，劉玉龍，邵英男，張鑫炎

（1.黑龍江省森林工程與環(huán)境研究所，哈爾濱 150081；2.森林可持續(xù)經(jīng)營與環(huán)境微生物工程黑龍江省重點(diǎn)實驗室）

0 前言

目前，傳統(tǒng)的、針對土壤微生物的研究，大都是基于培養(yǎng)分離的方法。隨著人們對土壤中微生物的原位生存狀態(tài)研究，越來越發(fā)現(xiàn)常規(guī)的分離培養(yǎng)方法很難全面地估價微生物群落多樣性。從土壤中簡單提取和平板培養(yǎng)計數(shù)不能得到土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能的信息。應(yīng)用現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，成功克服了傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)研究技術(shù)的局限性［1］。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法相比較，分子標(biāo)記具有許多明顯的優(yōu)越性，表現(xiàn)為：（1）直接以核酸作為研究對象，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，與發(fā)育時期無關(guān)，可用于植物基因型的早期選擇；（2）標(biāo)記數(shù)量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎是無限的；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；（4）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能區(qū)別純合基因型和雜合基因型，可提供完整的遺傳信息［2］。

近年來發(fā)展起來的隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA）分子遺傳標(biāo)記技術(shù)以檢測多態(tài)性DNA為目的，因快速、簡便的特點(diǎn)，其在物種分類和親緣關(guān)系鑒定、基因組分析等方面得到廣泛應(yīng)用，也可用于在DNA水平上反映微生物群落的多樣［3-5］。

但是RAPD標(biāo)記也有缺點(diǎn)，對反應(yīng)條件極為敏感，稍有改變就會影響擴(kuò)增產(chǎn)物的重現(xiàn)［6］，有時產(chǎn)生的多態(tài)性DNA電泳圖譜比較復(fù)雜，給樣品的檢測和結(jié)果分析帶來一定的困難。所以，為了實驗的準(zhǔn)確性，必須要對退火溫度、Mg2＋濃度、Taq酶用量等條件進(jìn)行優(yōu)化，使其反應(yīng)體系更加穩(wěn)定、可靠［7-10］。

1 材料與方法

1.1 土壤材料

研究區(qū)域為穆棱縣，在實驗區(qū)范圍內(nèi)共取了3種林型，分別為椴樹紅松林、云冷杉紅松林和蒙古櫟紅松林，分別在樣地中取樹木根際土壤，放入冰箱4℃冷藏保存。

1.2 土壤DNA樣品

實驗利用Mobio公司生產(chǎn)的強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（Power SoilTMDNA Islation Kit）對所采集的土壤進(jìn)行總DNA的提取。所得到的DNA樣品濃度均在600～1000ng／μL。OD260／OD280均在1.8左右。然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，主帶清晰且集中，沒有散狀的拖尾現(xiàn)象，膠孔沒有蛋白質(zhì)殘留，膠底部未見RNA污染。故用此方法得到的基因組DNA可用于后續(xù)試驗。

1.3 PCR產(chǎn)物的檢測

取8μL PCR產(chǎn)物與6×加樣緩沖液充分混合后，點(diǎn)入TAE為緩沖液的1%的瓊脂糖凝膠中，同時點(diǎn)入DL2000Marker進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中檢測PCR結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 RAPD退火溫度的優(yōu)化

圖1 退火溫度的優(yōu)化

退火是PCR反應(yīng)中較為重要的一步，退火溫度的選擇也決定著PCR的成敗。由于RAPD反應(yīng)的退火溫度較低，所以本試驗對退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。分別取35、36、37、38、39℃為退火溫度對相同引物［11-12］、相同模板、統(tǒng)一條件下進(jìn)行RAPD反應(yīng)，得到的結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（見圖1），退火溫度與泳道1～5相對應(yīng)（下同）。

由電泳圖1中可見泳道1出現(xiàn)輕微的彌散的條帶，無明顯條帶出現(xiàn)。泳道2出現(xiàn)了3～4條較暗的條帶。泳道3至泳道5中均出現(xiàn)了較多的且明亮的特異性條帶。其中泳道5中出現(xiàn)了較亮的幾條特異性的條帶，但條帶數(shù)少于3、4泳道。3與4的條帶數(shù)基本相同，但是泳道4中的條帶特異性好于泳道3。這可能由于35℃與36℃下，溫度過低造成兩條變性鏈重新結(jié)合形成雙鏈或者是溫度低于最適退火溫度，而造成擴(kuò)增條帶的不特異。而在39℃時，特異性提高，從而造成多態(tài)性降低。所以，選取38℃為退火溫度。

2.2 Mg2＋濃度優(yōu)化

Mg2＋的作用主要是dNTP-Mg2＋與核酸骨架相互作用并能影響聚合酶的活性，Mg2＋濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大。本實驗分別選取向20μL反應(yīng)體系中加入0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL濃度為25mmol／L的MgCl2，統(tǒng)一條件下進(jìn)行RAPD反應(yīng)，得到的結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（見圖2）。

圖2 Mg2＋濃度的優(yōu)化

由圖2可知，泳道1中只有2條較暗的條帶。泳道2～5中均得到了多態(tài)性較好的條帶。其中泳道3中得到的條帶最亮且多態(tài)性最好。這可能是由于泳道1中Mg2＋濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。而泳道5的Mg2＋濃度過高，抑制目的產(chǎn)物擴(kuò)增。所以選取向20μL體系中1.2μL MgCl2。

2.3 Taq酶用量的優(yōu)化

圖3 Taq酶用量的優(yōu)化

Taq DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中重要的組成部分，決定著PCR反應(yīng)能否進(jìn)行。本實驗分別選取向20μL反應(yīng)體系中加入0.15、0.2、0.25、0.30、0.35 μL規(guī)格為5U／μL的Taq DNA聚合酶。統(tǒng)一條件下進(jìn)行RAPD反應(yīng)，得到的結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（見圖3）。

由圖3可知，5個泳道中的擴(kuò)增效果差異較小，其中泳道3中得到的多態(tài)性較豐富且條帶較亮。故選擇向20μL體系中0.25μL Taq DNA聚合酶。

3 結(jié)論

通過對RAPD反應(yīng)體系中3個重要因素的優(yōu)化實驗，可以得到如下結(jié)論：1）退火溫度對RAPD反應(yīng)體系的影響較大，所以在進(jìn)行RAPD實驗時應(yīng)首先對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。本實驗得到的最優(yōu)退火溫度為38℃。2）Mg2＋濃度對RAPD有一定的影響。3）Taq DNA聚合酶的用量對RAPD反應(yīng)的影響較小。

利用上述優(yōu)化實驗最終建立適用于林地土壤微生物RAPD體系：在20μL PCR反應(yīng)體系中加入10ng土 壤 微 生 物 DNA 模 板；1.2μL 濃 度 為25mmol／L的 MgCl2；1.25μL 濃度為2.0mmol／L的dNTP；0.8μL濃度為20mmol／L的隨機(jī)引物；1.25U的 Taq DNA 聚合酶；2μL 10×PCR Buffer（Mg2＋Free）；無菌去離子水補(bǔ)足體積。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，進(jìn)如40個循環(huán)階段，94℃變性1min，38℃退火1min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸2min。72℃延伸7min，4℃保存。

［1］ 張海涵，唐明，等.黃土高原5種造林樹種菌根根際土壤微生物群落多樣性研究［［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，3（5）：85-90.

［2］ 賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29（4）：1-10.

［3］ 夏北成，ZhouJiZhong，James M.Tiedje.植被對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，1998，9（3）：296-300.

［4］ 陳灝，唐小樹，林潔.不經(jīng)培養(yǎng)的農(nóng)田土壤微生物種群構(gòu)成及系統(tǒng)分類的初步研究［J］.微生物學(xué)報，2002，42（4）：478-483.

［5］ 鄭成木.植物分子標(biāo)記原理與方法［M］.長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：1.

［6］ 姜自鋒，林乃栓，徐梅.RAPD技術(shù)及其應(yīng)用中的一些問題［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，31（3）：356-360.

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［10］ 姜自鋒，林乃栓，徐梅.RAPD技術(shù)及其應(yīng)用中的一些問題［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2002，31（3）：356-360.

［11］ 曹立成.甜菜 M14品系分子標(biāo)記的研究［D］.哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2006.

［12］ 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：1.