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        樺褐孔菌提取物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)研究

        2014-12-28 07:54:08馬思慧程萍方研王萍
        中國(guó)林副特產(chǎn) 2014年1期
        關(guān)鍵詞:孔菌定容丙酮

        馬思慧,程萍,方研,王萍

        (東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,哈爾濱 150040)

        樺褐孔菌[Inonotusobliques(Fr.)Pilát]是來自西伯利亞原始森林中的藥用真菌,具有預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)細(xì)胞衰老、癌癥、糖尿病等疾病的功效[1-5]。這些功能的發(fā)揮與其抗氧化活性密不可分。因此相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在其抗氧化活性,但對(duì)于其提取物中哪種物質(zhì)的抗氧化性較好鮮有報(bào)道。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同溶劑的提取物體外抗氧化活性的評(píng)價(jià),分析各活性物質(zhì)含量與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性,確定高效抗氧化活性成分,為以后對(duì)樺褐孔菌的進(jìn)一步利用提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        樺褐孔菌,黑龍江省哈爾濱市東北林副特產(chǎn)專營(yíng)店;DPPH,Sigma Aldrich公司;總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法),碧云天生物技術(shù)研究所;2-硫代巴比妥酸,上海源葉生物科技有限公司;2-脫氧-D-核糖,上海拜力生物科技有限公司;槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品,中國(guó)藥品生物制品檢定所。

        1.2 儀器與設(shè)備

        722 型可見光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;JA2003型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHB-B循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司;DG3022型酶標(biāo)儀 華東電子管廠。

        1.3 方法

        1.3.1 原料預(yù)處理

        取樺褐孔菌粉碎,過80目篩。裝入密封袋備用。

        1.3.2 樺褐孔菌有效成分的提取

        分別稱取12份2.0g樺褐孔菌粉末于磨口錐形瓶中,按料液比1∶50分別加入水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇、20%丙酮、40%丙酮、60%丙酮、80%丙酮、100%丙酮和異丙醇,50℃ 水 浴 提 取 2h。3500r/min 離 心 分 離10min,收集上清液。將殘?jiān)凑障嗤姆椒ㄔ偬崛∫淮?。將每次收集的上清液?5℃條件下旋蒸濃縮,冷藏備用。

        1.3.3 多糖含量的測(cè)定

        1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        參照Dubois,M.,Gilles,KA[6]等人的實(shí)驗(yàn)方法,采用苯酚-硫酸比色法,準(zhǔn)確稱取0.1000g葡萄糖,用蒸餾水定容至1000mL葡萄糖質(zhì)量濃度為0.1g/L密量取該溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL管中,蒸餾水定容至1mL搖勻。再加入5%苯酚試劑0.6mL振蕩,再加入3.6mL迅速振蕩搖勻,于室溫放置30min后在490nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖的濃度(C)W為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y=8.8471x-0.0049,相關(guān)系數(shù) R2=0.9983。

        1.3.3.2 多糖含量的測(cè)定[7]

        將不同溶劑提取的樺褐孔菌粗提物用蒸餾水定容至100mL分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)(m)。吸取樣品液1.0mL,置干燥具塞試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟加入苯酚和濃硫酸溶液,測(cè)吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中多糖含量(f)[8],用公式計(jì)算多糖含量=m×f×100

        1.3.4 總酚含量的測(cè)定

        1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]

        準(zhǔn)確稱取沒食子酸0.025μg,加蒸餾水定容至100mL。精密量取該溶液0.0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mL,分別置于25mL容量瓶中,用蒸餾水定容。分別加入1mL福林酚試劑,混勻,4min后加入2mL 7.5% 碳酸鈉溶液,45℃水浴15min,于765nm處測(cè)定吸光值。以沒食子酸的濃度(C)W為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y=0.0047x+0.0047,相關(guān)系數(shù)R2=0.9961。

        1.3.4.2 總酚含量的測(cè)定[10]

        將不同溶劑提取的樺褐孔菌粗提物用蒸餾水定容至100mL,分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL試管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)(m)。吸取樣品液1.0mL,置干燥具塞試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟測(cè)吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中總酚含量(f),用公式計(jì)算總酚含量=m×f×100。

        1.3.5 黃酮含量的測(cè)定

        1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11]

        準(zhǔn)確稱取槲皮素0.002g,加95%乙醇定容至20mL。分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL至10mL容量瓶中,用95%乙醇定容。分別轉(zhuǎn)入試管中加2%的氯化鋁2mL,室溫下反應(yīng)30min。于360nm下讀吸光值。以槲皮素的濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y=2.1926x-0.0012,相關(guān)系數(shù) R2=0.9992。

        1.3.5.2 黃酮含量的測(cè)定含量測(cè)定[12]

        將不同溶劑粗提物用蒸餾水定容至100mL,分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL試管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)(m)。分別準(zhǔn)確吸取1mL,置干燥具塞試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟加入2%的氯化鋁2mL,95%乙醇定容至10mL,室溫下反應(yīng)30min,于360nm下讀吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中黃酮含量(f)[13],用公式計(jì)算黃酮含量=m×f×100。

        1.3.6 粗提物抗氧化性的測(cè)定

        1.3.6.1 清除 DPPH·能力[14]

        準(zhǔn)確稱取6.2mg DPPH,用無水乙醇溶解定容至100mL,各取4mL不同溶劑提取的樣品溶液和該溶劑加入2mL 1×10-4mol/L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色試管中,迅速混勻,避光反應(yīng)30min后在517nm下測(cè)定吸光度,同時(shí)用水進(jìn)行空白試驗(yàn)。每個(gè)樣品平行進(jìn)行3次,用以下公式計(jì)算清除率(K)[15]。

        式中,Ai:4mL樣品溶液+2mL DPPH溶液的吸光值;Aj:4mL提取溶劑+2mL DPPH溶液的吸光值;Ac:4mL水+2mLDPPH溶液的吸光值。

        1.3.6.2 總還原力FRAP

        標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的準(zhǔn)備[16]:稱取27.8mg本試劑盒提供的FeSO4·7H2O,溶解并定容到1mL,此時(shí)濃度即為100mmol/L。取適量100mmol/L FeSO4溶液用蒸餾水稀釋至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50mmol/L。

        總抗氧化能力的測(cè)定[17]:在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180μL FRAP工作液。在空白對(duì)照孔中加入5μL蒸餾水;標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入5μL各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液,樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5μL各種樣品,輕輕混勻,于37℃孵育3~5min后測(cè)定593nm處吸光值。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        用SPSS軟件對(duì)粗提物中多糖、總酚、黃酮含量和各抗氧化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

        2 結(jié)果與分析

        圖1 不同溶劑的多糖含量

        2.1 不同溶劑提取物中多糖的含量

        圖1可知,樺褐孔菌提取物中多糖含量隨提取溶劑不同而不同。其中,40%乙醇提取物的多糖含量最多,為64.2mg/g;100%丙酮提取物含量最少,為1.87mg/g。不同溶劑提取物物中多糖含量的大小順序?yàn)椋?0%乙醇>20%乙醇>60%乙醇>水>20%丙酮>80%乙醇>60%丙酮>80%丙酮>無水乙醇>異丙醇>正丁醇>100%丙酮。

        2.2 不同溶劑提取物中總酚的含量

        圖2 不同溶劑的多酚含量

        由圖2可知,樺褐孔菌提取物中多酚含量隨提取溶劑不同而有所變化。其中,20%丙酮提取物中多酚含量最多,為55.26mg/g;正丁醇提取物中多酚含量最少,為0.95mg/g。按照提取物中多酚含量由多到少的順序排序,為20%丙酮>60%丙酮>40%丙酮>60%乙醇>40%乙醇>80%丙酮>20%乙醇>80%乙醇>水>無水乙醇>異丙醇>100%丙酮>正丁醇。

        2.3 不同溶劑提取物中黃酮的含量

        由圖3可知,樺褐孔菌提取物中黃酮含量隨提取溶劑不同而有所變化。其中,20%丙酮提取物中黃酮含量最多,為15.12mg/g;正丁醇提取物中黃酮含量最少,為0.067mg/g。按照各溶劑提取物中黃酮含量的多少排序,為20%丙酮>40%乙醇>20%乙醇>60%乙醇>40%丙酮>水>60%丙酮>80%乙醇>80%丙酮>無水乙醇>丙酮>異丙醇>正丁醇。

        圖3 不同溶劑的黃酮含量

        2.4 不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

        圖4 不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力

        DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,通過檢測(cè)樺褐孔菌粗提物對(duì)DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。由圖4可知,不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力不同。其中,60%乙醇提取物清除率最大,為0.75;正丁醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力最小,為0.10。各溶劑對(duì)DPPH·的清除能力大小順序?yàn)椋?0%乙醇>80%乙醇>60%丙酮>20%乙醇>40%乙醇>80%丙酮>水,40%丙酮>20%丙酮>無水乙醇>異丙醇>100%丙酮>正丁醇。

        2.5 不同溶劑提取物總還原能力的測(cè)定(FRAP法)

        圖5 不同溶劑提取物FRAP值

        由圖5可知,不同溶劑提取物的FRAP值不同。其中60%乙醇提取物的FRAP值最大,為11.03;異丙醇提取物的FRAP值最小,為1.22。各溶劑提取物的FRAP值大小順序?yàn)椋?0%乙醇>60%丙酮>40%乙醇>40%丙酮>20%乙醇>水>80%丙酮>20%丙酮>80%乙醇>無水乙醇>丙酮>正丁醇>異丙醇。

        2.6 相關(guān)性分析結(jié)果

        表1 相關(guān)性分析結(jié)果

        由表1可知,多糖含量和DPPH·清除率、FRAP值呈顯著性相關(guān),其相關(guān)性系數(shù)分別為0.851和0.706,均大于多酚含量、黃酮含量與二個(gè)抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)。

        3 結(jié)論

        不同溶劑提取物中多糖含量范圍是1.87~64.2mg/g;多酚含量范圍是0.95~55.26mg/g;,黃酮含量范圍是0.067~15.12mg/g。不同溶劑提取物清除DPPH·的清除率范圍是0.10~0.75,F(xiàn)RAP值的范圍是1.22~11.03。且多糖含量與各抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性最大,說明樺褐孔菌多糖在其抗氧化性中發(fā)揮主要作用。本研究對(duì)于開發(fā)具有清除人體自由基的產(chǎn)品具有重要意義。

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