程俊文，賀亮＊，胡傳久，魏海龍，付立忠，鄒景泉，韓素芳，韋朝陽

（1.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，杭州 310023；2.浙江大學生命科學學院，杭州 310058）

桑黃（Phellinusigniarius）俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等，是一種珍貴的大型藥用真菌。目前，桑黃是國際公認的生物抗癌領域中效果最好的真菌［1］。桑黃具有抗癌、抗炎、抗氧化、提高免疫力、保肝護肝等多種藥用功效［2-3］，現(xiàn)代藥理學研究表明，三萜、多糖和黃酮類物質(zhì)是其關鍵藥性成分［4］。目前，桑黃在國際市場上供不應求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國內(nèi)又剛剛起步，因此，采用液體發(fā)酵技術進行桑黃的規(guī)模化生產(chǎn)具有廣闊的前景。

中藥中含有豐富的纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等營養(yǎng)成分以及萜類、黃酮類、生物堿、皂甙類等活性物質(zhì)［5］，有研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量中藥成分，可促進藥用真菌的生長或提高活性產(chǎn)物的產(chǎn)量［6］，但中藥在桑黃液體發(fā)酵上的應用尚未見報道。本研究選用5味不同中藥添加到桑黃發(fā)酵培養(yǎng)基中，探究中藥對其菌體生長、代謝產(chǎn)物的合成的影響，為提高桑黃活性物質(zhì)的液體發(fā)酵生產(chǎn)探索一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

桑黃（Phellinusigniarius）：由浙江省林業(yè)科學研究院生物技術研究所實驗室保藏。

1.1.2 中藥材

薏苡仁、苦蕎、銀杏葉、連翹、金銀花購自杭州華東醫(yī)藥中藥材分公司，粉碎后備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PAD）：馬鈴薯浸出液200g／L，葡萄糖20g／L，瓊脂15g／L，pH自然，在121℃下滅菌30min，備用。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g／L，酵母粉5g／L，KH2PO41.0g／L，MgSO40.5g／L，pH 自然，在121℃下滅菌30min，備用。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20g／L，酵母粉3g／L，蛋白胨4g／L，KH2PO41.0g／L，MgSO40.5g／L，pH自然。

1.1.4 主要儀器

可見分光光度計（U-1900）；超凈工作臺（SWCJ-2F）；電子分析天平（BSA224S）；高壓滅菌鍋（SX500）；恒溫振蕩器（ZHWY-211B）；旋轉蒸發(fā)儀（R-210）；多功能高速離心機（CL31R）；真空干燥箱（DZF6020）；冷凍干燥機（LGJ-10C）等。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取液的制備

稱取適量中藥材（已粉碎，過60目），加6倍水浸泡0.5h，用電爐煎熬，調(diào)整適當?shù)募訜釡囟?，保持溫和的沸騰狀態(tài)，煮沸30min，過濾收集提取液。重復提取1次，合并2次藥汁，用8層紗布過濾，所得藥汁用于桑黃液體搖瓶培養(yǎng)。

1.2.2 搖瓶液體培養(yǎng)

種子液培養(yǎng)：將在PDA斜面培養(yǎng)基中活化后的桑黃菌種，取5mm2（即黃豆大?。┙尤霚缇蠓N子液培養(yǎng)基中，150mL／500mL錐形瓶，28℃，130 r／min下?lián)u床培養(yǎng)7d。

液體發(fā)酵：將一定量的中藥水提物加入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，充分溶解混勻，分裝于500mL錐形瓶中，裝液量為200mL，將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌30min。冷卻后以10% 的接種量接入培養(yǎng)基中，在25℃，60r／min搖床中培養(yǎng)5d。每個試驗設3個平行，并設置1組對照試驗（不添加中藥水提物的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件相同）。

1.2.3 菌絲生物量的測定

發(fā)酵液經(jīng)離心，沉淀，用水洗滌3次，再次離心，沉淀的菌絲體，置于65℃的干燥箱內(nèi)干燥至恒重，稱重得桑黃生物量。

1.2.4 胞外多糖含量的測定

取發(fā)酵上清液，加4倍95%乙醇沉淀，4℃放置24h，3000r／min離心20min，棄去上清液，用85%乙醇洗滌沉淀兩次，3000r／min離心20min棄去上清液。所得沉淀待酒精完全揮發(fā)后，溶于蒸餾水以硫酸-苯酚法進行測定［7］。

2 結果與分析

2.1 中藥提取物對桑黃發(fā)酵的影響

表1 中藥提取物對桑黃深層發(fā)酵的影響

由表1可知，從桑黃發(fā)酵生物量來看，在所試驗的5種中藥水提物中，銀杏葉、苦蕎、薏苡仁對桑黃菌絲體的生長具有較好的促進作用，這3種中藥對應各組的生物量分別是對照組的1.29～1.54倍；金銀花、連翹對桑黃生長具有一定的抑制作用，生物量為對照的61.9%和47.4%。

從桑黃發(fā)酵胞外多糖來看，在所試驗的5種中藥水提物中，銀杏葉、薏苡仁、苦蕎對桑黃胞外多糖的生長具有一定的促進作用，這3種中藥對應各組的胞外多糖分別是對照組的1.16～1.59倍；金銀花、連翹對桑黃胞外多糖生成具有一定的抑制作用，胞外多糖僅為對照的41%和44.5%。

2.2 不同添加量的中藥水提物對桑黃液體發(fā)酵的影響

圖1 不同中藥對桑黃深層發(fā)酵菌絲生物量的影響

由圖1可知，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉3味中藥在低濃度時均能促進桑黃的生長，但隨著添加量的增加，其生物量呈現(xiàn)了下降的趨勢，說明這幾味中藥的用量應該控制在一定范圍內(nèi)，其中薏苡仁和苦蕎的最佳添加量在2%，銀杏葉的最佳添加量在4%。在試驗濃度范圍內(nèi)，金銀花和連翹隨著濃度的增加，對桑黃深層發(fā)酵菌體生長的抑制作用越明顯。

圖2 不同中藥對桑黃深層發(fā)酵胞外多糖生產(chǎn)的影響

由圖2可知，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉3味中藥在低濃度時均能促進桑黃胞外多糖的分泌，但隨著添加量的增加，其胞外多糖都呈現(xiàn)了下降的趨勢，說明這幾味中藥的用量應該控制在一定范圍內(nèi)，其中薏苡仁和苦蕎的最佳添加量在2%，銀杏葉的最佳添加量在4%。在試驗濃度范圍內(nèi)，金銀花和連翹隨著濃度的增加，對桑黃深層發(fā)酵菌體生長的抑制作用越明顯。

3 結論

中藥中的成分與藥用真菌的生長代謝間存在著相互作用，因此中藥中的某些成分可能刺激藥用真菌的生長或活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生［8］。本文開展了添加多種中藥進行桑黃發(fā)酵的試驗研究，對適合桑黃發(fā)酵的中藥種類進行篩選，以期提高桑黃液體發(fā)酵菌絲體生長及其胞外多糖的生產(chǎn)。研究表明，薏苡仁、苦蕎和銀杏葉這3味中藥在低添加量時，不僅對桑黃深層發(fā)酵菌絲體生長有促進作用，還能促進胞外多糖的分泌，隨著添加量的升高，生物量和胞外多糖在一定劑量下都出現(xiàn)了峰值。金銀花和連翹對桑黃桑黃深層發(fā)酵菌絲體生長和胞外多糖的分泌具有一定的抑制作用。至于中藥對桑黃發(fā)酵的影響機理目前尚不清楚，還有待于進一步研究。

［1］ 戴玉成.藥用擔子菌：鮑氏層孔菌（桑黃）的新認識［J］.中草藥，2003，34（1）：94-95.

［2］ LI Ge，KIM D H，KIM T D，et al.Protein-bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2／M phase arrest and apoptosis in SW480human colon cancer cells［J］.Cancer Letters，2004，216（2）：175-181.

［3］ Shone M Y，Kim T H，Sung N J.Antioxidants and free radical scavenging activityof Phellinus baumii（Phellinus of Hymenochaetaceae）extracts［J］.Food Chemistry，2003，82（4）：593-597.

［4］ 呂英華，王建芳，李玉平，等.藥用真菌桑黃的研究進展［J］.蠶業(yè)科學，2009，35（1）：204-210.

［5］ 侯曉梅，陳敏青，張慧蕾，等.中藥提取物對桑黃深層發(fā)酵的影響 ［J］.食品科技，2013，38（9）：185-188.

［6］ Liu G Q，Xiao H X，Wang X L，et al.Stimulated production of triterpenoids of Ganoderma lucidum by an ether extract from the medicinal insect，Catharsius molossus，and identification of the key stimulating active components ［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，165（1）：87-97.

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［8］ 楊海龍，唐華.中藥對藥用真菌深層發(fā)酵的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（4）：128-131.