朱品紅，李志輝，楊模華

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

赤皮青岡ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

朱品紅，李志輝，楊模華

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410004)

為建立適宜于赤皮青岡ISSR分析的擴(kuò)增體系，以赤皮青岡葉片基因組DNA為材料，采用單因素和正交設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法系統(tǒng)地測(cè)試模板DNA、Mg2+、引物、磷酸堿基脫氧核苷（dNTPs）濃度，Taq DNA聚合酶用量和退火溫度這6個(gè)因素對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響。綜合分析表明：優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系為20 μL反應(yīng)總體系中，含20 ng模板DNA，2.5 mmoL/L Mg2+，0.2 mmoL/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，0.2 μmoL/L引物；UBC 808號(hào)作引物最佳退火溫度為59.3℃。這一優(yōu)化體系的建立為進(jìn)一步開展赤皮青岡遺傳多樣性的ISSR分析奠定了基礎(chǔ)。

赤皮青岡；ISSR-PCR；正交設(shè)計(jì)；單因素試驗(yàn)；優(yōu)化

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)( inter-simple sequence repeat，ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的一種新型分子標(biāo)記法，由Zietkiew ica等[1]于1994年在SSR (Simple Sequence Repeat)基礎(chǔ)上創(chuàng)建的，綜合了SSR和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、操作方便、成本低廉等特點(diǎn)。因此近年來已廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、遺傳多樣性分析、基因定位和種質(zhì)資源鑒定[2-8]等方面。

赤皮青岡Cyclobalanopsis gilva (Bl.) Oerst.屬殼斗科青岡屬，常綠喬木，樹皮暗赤褐色，又名紅椆、赤皮稠，是珍貴的硬木樹種。主要產(chǎn)自我國福建、湖南、浙江、貴州、臺(tái)灣等省。適應(yīng)性強(qiáng)，生于海拔300～1 500 m的山地，較耐干旱脊薄，能在丘陵酸性紅壤與石灰?guī)r發(fā)育而成的鈣質(zhì)土壤生長(zhǎng)[9]。但近年來由于人類的影響，赤皮青岡天然種群逐漸枯竭，僅保存下少量的古木大樹[10]。目前國內(nèi)外對(duì)赤皮青岡的研究主要集中在地理分布[11]，造林技術(shù)[9]，理化特性[12-14]等方面。而關(guān)于ISSR標(biāo)記技術(shù)的研究尚未見報(bào)道。本研究采用單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，建立了適合赤皮青岡的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于赤皮青岡的種質(zhì)資源鑒定、遺傳變異分析、系統(tǒng)進(jìn)化等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

赤皮青岡種子來源于湖南省張家界市永定區(qū)，于2012年在汨羅科技示范園育苗，2013年4月將新鮮葉片置于低溫儲(chǔ)藏箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，洗凈、晾干，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司提供的ISSR引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。經(jīng)初步篩選，確定引物808號(hào)即(AG)8C作為本次反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)的固定引物。擴(kuò)增反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行，試驗(yàn)所用Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs購自TINGEN公司，標(biāo)準(zhǔn)分子量( Marker)DL2000購自東盛公司。

1.3 基因組DNA的提取與檢測(cè)

采用OMEGA公司生產(chǎn)的試劑盒對(duì)赤皮青岡DNA進(jìn)行提取，方法參照說明書。λDNA測(cè)定提取液濃度，溴化乙錠（EB）染色，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的6個(gè)因素，分別設(shè)置了不同的梯度水平，見表1。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定最初的反應(yīng)體系為：40 ng的模板 DNA，1.4 μL 的 Mg2+，0.8 μL 引物，0.3 μL 的 dNTPs，0.3 μL 的 Taq DNA 聚 合 酶，10×Buffer緩沖液2.0 μL；PCR初步反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，共循環(huán)35次；最后72℃延伸7 min；4℃保溫。

1.4.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)體系

對(duì)模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶5個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，因素水平參考單因素試驗(yàn)，依據(jù)PCR重復(fù)2次的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行直觀分析。

1.4.3 ISSR-PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

ISSR-PCR產(chǎn)物用EB染色，1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。5 V/cm恒定電壓下電泳約1.5 h，然后用Bio-Rad紫外凝膠成像儀拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

赤皮青岡葉片基因組DNA的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。圖中主帶明亮清晰，無明顯拖帶，點(diǎn)樣空基本干凈，無雜質(zhì)，說明蛋白質(zhì)、多糖、酚類等基本去除，滿足ISSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 赤皮青岡葉片基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis pattern of genomic DNA of the leaves of C. gilva

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

適宜的模板DNA濃度是保證ISSR-PCR良好擴(kuò)增效果的一個(gè)重要因素，DNA模板濃度過低，擴(kuò)增不穩(wěn)定甚至無法擴(kuò)增；而濃度過高，又相應(yīng)增加了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物[15]。此次單因素試驗(yàn)設(shè)置了7個(gè)模板DNA濃度梯度，見圖2，從圖可以看出：赤皮青岡ISSR-PCR體系中，對(duì)DNA模板濃度的許可范圍較大。在20 μL的反應(yīng)總體系中所加的DNA模板體積（濃度50 ng/ μL）大于1.4 μL時(shí)擴(kuò)增條帶較弱，不清晰。當(dāng)加入的體積在0.4～1.2 μL之間時(shí)擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰。

2.2.2 引物濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

引物與模板DNA的互補(bǔ)程度決定了PCR產(chǎn)物的特異性，是PCR反應(yīng)的關(guān)鍵，濃度過高可能引起模板與引物的錯(cuò)配，PCR反應(yīng)特異性下降，還會(huì)增大形成引物二聚體的幾率；濃度過低則不能進(jìn)行有效擴(kuò)增。從圖3可以看出：隨著引物濃度的增高，擴(kuò)增條帶數(shù)由多到少，反應(yīng)的穩(wěn)定性也逐漸降低。當(dāng)引物（濃度10 μmoL/L）加入量為0.4 μL時(shí)擴(kuò)增條帶清晰，數(shù)量較多，特異性強(qiáng)。加入量為0.6、0.8、1.0 μL時(shí)條帶清晰度下降，特異性差。因此選用引物體積0.4 μL作為ISSR-PCR反應(yīng)體系中最適加入量。

圖2 不同水平模板DNA對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of different DNA template levels on ISSR amplif i cation

2.2.3 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

Mg2+濃度影響了引物與模板雙鏈的解鏈。退火溫度、Taq DNA聚合酶的活性和產(chǎn)物的特異性也都受Mg2+濃度的影響[16-17]。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著Mg2+濃度升高，PCR擴(kuò)增的特異性降低，然而濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量，甚至不能擴(kuò)增出條帶。從圖4可以看出20 μL的反應(yīng)總體系中Mg2+（濃度50 mmol/L）加入量為0.6 μL時(shí)無擴(kuò)增條帶。加入量為1.8 μL時(shí)條帶背景模糊，主次帶

圖4 不同水平Mg2+對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig.4 Effect of different Mg2+ levels on ISSR amplif i cation

2.2.5 Taq DNA聚合酶用量對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

在ISSR-PCR反應(yīng)中，Taq DNA聚合酶的活性與濃度對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有著重要的影響，濃度過低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足或者不能擴(kuò)增，濃度過高會(huì)產(chǎn)生彌散現(xiàn)象，非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增多。值得注意的是不同廠家生產(chǎn)的酶，或同一廠家不同批次的酶對(duì)不分明。在加入0.8～1.4 μL時(shí)擴(kuò)增條帶較多，其中加入1.0 μL時(shí)最清晰穩(wěn)定，故確定1.0 μL作為ISSR-PCR反應(yīng)體系中Mg2+最適加入量。

圖3 不同水平引物對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of different primer levels on ISSR amplif i cation

2.2.4 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響

dNTPs是PCR反應(yīng)中DNA序列擴(kuò)增的原料，濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，過高即能產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，又會(huì)與體系中游離的Mg2+結(jié)合，從而減少了Mg2+含量。如圖5所示，當(dāng)20 μL 的反應(yīng)總體系中dNTPs（濃度10 mmol/L）加入量達(dá)到1.0 μL時(shí)已無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。加入0.8 μL時(shí)擴(kuò)增條帶較少，加入0.2，0.6 μL時(shí)條帶清晰可見，而加入0.4 μL時(shí)主次帶分明，清晰度最高。因此，本實(shí)驗(yàn)確定0.4 μL作為ISSR-PCR反應(yīng)體系中dNTPs最適加入量。反應(yīng)效果也存在差異[18]。如圖6所示在20 μL 的反應(yīng)總體系中Taq DNA聚合酶（濃度5 U/ μL）加入量為0.1 μL時(shí)，擴(kuò)增條帶弱，不能辨析，加入0.2μL時(shí)條帶較強(qiáng)，背景清晰。當(dāng)加入量逐漸增加時(shí)拖尾現(xiàn)象開始嚴(yán)重，達(dá)到0.5 μL時(shí)無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。因此選用0.2 μL作為ISSR-PCR反應(yīng)體系中Taq酶最適加入量。

圖5 不同水平dNTPs對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig. 5 Effect of different dNTPs levels on ISSR amplif i cation

圖6 不同水平Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig. 6 Effect of different Taq DNA polymerase levels on ISSR amplif i cation

2.2.6 最優(yōu)ISSR-PCR退火溫度的篩選

由于作為ISSR-PCR標(biāo)記的引物長(zhǎng)度、堿基組成、GC堿基含量及濃度等各不相同，各個(gè)引物的Tm值也有所不同。一般的溫度范圍是45～65℃[19]。退火溫度偏高則引物與模板難結(jié)合，條帶較少，背景弱；退火溫度偏低則弱帶較多，特異性差。若擴(kuò)增結(jié)果相似則選擇較高退火溫度，以提高引物與模板結(jié)合的特異性。本試驗(yàn)在PCR梯度擴(kuò)增儀上設(shè)置退火溫度從48℃到62℃，自動(dòng)生成8個(gè)溫度梯度，見圖7。由圖可以看出退火溫度為48～56.8℃時(shí)，由于溫度偏低，導(dǎo)致背景模糊，雜帶較多，特異性差；退火溫度高于61.0℃時(shí)擴(kuò)增受到抑制，電泳條帶少。當(dāng)溫度為59.3℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物最多，條帶清晰。因此，本實(shí)驗(yàn)確定引物808的最佳退火溫度為59.3℃。

圖7 不同水平退火溫度對(duì)ISSR擴(kuò)增的影響Fig. 7 Effect of different annealing temperature levels on ISSR amplif i cation

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs及Taq DNA聚合酶5個(gè)因素在4個(gè)水平上進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立L16(45)正交表（表2）。各因素水平分別為DNA模板：0.4、0.6、0.8、1.2 μL；引物：0.4、0.6、0.8、1.0 μL；Mg2+：0.8、1.0、1.2、1.4 μL；dNTPs：0.2、0.4、0.6、0.8 μL；Taq 酶：0.15、0.2、0.3、0.4 μL。

表2 赤皮青岡ISSR反應(yīng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L16(45)Table 2 ISSR reaction orthogonal design L16(45) of C.gilva

參考何正文等[20]的方法，根據(jù)L16(45)正交試驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果(圖8)，分析譜帶的強(qiáng)弱、數(shù)量、背景清晰度及雜帶多少，對(duì)其進(jìn)行直觀分析，打分。最優(yōu)的記為16分，最差的記為1分。則本次試驗(yàn)16個(gè)處理的分?jǐn)?shù)依次為：8、16、15、11、13、6、1、14、4、12、2、3、9、5、7、10。根據(jù)分?jǐn)?shù)進(jìn)行直觀分析（表3）得出各因素對(duì)赤皮青岡ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響程度即極差值R，R值越大說明該因素對(duì)反應(yīng)的影響越顯著。而Ki值反映了各個(gè)因素同一水平下的試驗(yàn)值之和，ki值則反映了各個(gè)因素水平對(duì)反應(yīng)的影響效果，ki值越大說明該水平對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的影響越明顯。由極差值R反映出各因素對(duì)赤皮青岡ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響程度由高到低依次是：Taq DNA聚合酶、模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物。由ki值得出理論最佳反應(yīng)體系是：模板DNA（50 ng/ μL）0.4 μL、Mg2+（50 mmol/L）1.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL、引物（10μmoL/L）0.4 μL。各因素的最佳水平組合并沒在16個(gè)處理中出現(xiàn)，但是與分值最高的2號(hào)處理接近。所以，在利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化反應(yīng)體系時(shí)，可以不經(jīng)過直觀分析，直接根據(jù)電泳結(jié)果也能獲得較優(yōu)的反應(yīng)體系[21]。

圖8 正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 8 Electrophoresis of orthogonal design PCR products

表3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析Table 3 Data analysis of orthogonal tests

通過正交試驗(yàn)確定模板DNA最佳含量為0.4μL。Mg2+、引物和dNTPs在單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果中最佳含量相同，分別是1.0 μL、0.4 μL和0.4 μL。正交試驗(yàn)中Taq酶的最佳含量為0.3 μL比單因素試驗(yàn)的最佳值高出0.1 μL，考慮到經(jīng)濟(jì)原因，選擇0.2 μL作為PCR反應(yīng)的最佳含量。綜合單因素試驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，可以得到赤皮青岡ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，見表4。

表4 赤皮青岡ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系Table 4 The most suitable ISSR-PCR system for C.gilva

2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)

圖9是在本研究得出的最佳反應(yīng)體系條件下以808號(hào)作引物，退火溫度59.3℃，擴(kuò)增18個(gè)樣品的PCR電泳結(jié)果。從圖可以看出，優(yōu)化后的體系均能擴(kuò)增出清晰度高、多態(tài)性好的條帶，說明本研究確立的赤皮青岡ISSR-PCR反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。

圖9 808號(hào)引物在優(yōu)化后的體系下擴(kuò)增18個(gè)樣品的PCR結(jié)果Fig.9 The PCR results of 18 specimens with peimer 808 and optimized reaction system

3 小結(jié)與討論

因?yàn)橥嘶饻囟葧?huì)隨著物種和引物種類的不同而發(fā)生改變，因此在進(jìn)行某一物種的ISSR-PCR體系優(yōu)化時(shí)，對(duì)不同的引物退火溫度應(yīng)重新進(jìn)行篩選。本研究確定在進(jìn)行赤皮青岡ISSR-PCR擴(kuò)增時(shí)808號(hào)作引物的最佳退火溫度為59.3℃。在實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程中還應(yīng)注意盡可能使用同一廠家的藥品和試劑，以便保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性。

前人在進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時(shí)有的只考慮各因素不同水平對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，忽略了因素之間的交互作用，有的只采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，使結(jié)果的評(píng)價(jià)帶有一定的主觀性，降低了最佳反應(yīng)水平的的可靠程度。本研究則綜合運(yùn)用兩種試驗(yàn)方法，在一定程度上避免了各自的局限性。通過此次研究確立的赤皮青岡ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，將為赤皮青岡及其近緣種的種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性的分析研究工作奠定基礎(chǔ)。

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Establishment and optimization of Cyclobalanopsis gilva ISSR-PCR reaction system

ZHU Pin-hong, LI Zhi-hui, YANG Mo-hua
(School of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ In order to establish the optimal system of ISSR-PCR for Cyclobalanopsis gilva, with the genomic DNA of C.gilva leaves as material, single factor test and orthogonal experiment design were used to systematically test six parameters of ISSR-PCR which include template DNA, Mg2+, primers, dNTPs concentration, dose of Taq DNA polymerase and annealing temperature.Integrated analysis implies that the optimal reaction system of ISSR (20 μL) is:20 ng template DNA, 2.5 mmoL/L Mg2+, 0.2 mmoL/L dNTPs, 0.2 μmoL/L primers and 1.0 U Taq DNA polymerase, if UBC808 as the primers in ISSR-PCR that the optimized annealing temperature is 59.3℃.The establishment of the optimal system lays an important foundation for using ISSR technology in research C.gilva genetic diversity in future.

∶ Cyclobalanopsis gilva; ISSR-PCR; orthogonal design; single factor tests; optimization

S723.7

A

1673-923X(2014)06-0061-05

2013-09-04

“十二五”國家科技支撐項(xiàng)目“楸樹和赤皮青岡珍貴用材林定向培育技術(shù)研究與示范”（2012BAD21B03）

朱品紅（1987-），女，河南焦作人，碩士研究生，從事林木定向培育研究

李志輝（1957-），男，湖南安化人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林培育教學(xué)和研究工作；

E-mail：lzh1957@126.com

[本文編校：吳 彬]