閆麗君，王紅霞 ，黃芳芳，何長(zhǎng)青，梁 艷，徐剛標(biāo)

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100010）

伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

閆麗君1，王紅霞2，黃芳芳1，何長(zhǎng)青1，梁 艷1，徐剛標(biāo)1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100010）

以伯樂(lè)樹(shù)葉片為材料，利用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)影響伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR擴(kuò)增的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR最佳反應(yīng)體系（20 μL）為：Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，引物0.3 μmol/L，DNA 90 ng。這為利用SSR標(biāo)記進(jìn)一步開(kāi)展伯樂(lè)樹(shù)種群遺傳多樣性研究奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

伯樂(lè)樹(shù)；SSR-PCR；體系優(yōu)化

伯樂(lè)樹(shù)Bretschneidera sinensis Hemsl.為伯樂(lè)樹(shù)科伯樂(lè)樹(shù)屬落葉喬木，是我國(guó)特有的單科、單屬、單種孑遺植物[1]，零星間斷分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)[2-3]。伯樂(lè)樹(shù)自然更新困難[4]，人為干擾嚴(yán)重，現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài)，已被列為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物[5]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由幾個(gè)（多為1-6個(gè)）堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，長(zhǎng)度較短，200 bp左右，廣泛分布于基因組的不同位置[6]。與其它的分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，具有分布廣、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、可靠性高的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析[7]。

本研究擬采用單因素與正交試驗(yàn)相結(jié)合方法，對(duì)影響伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR擴(kuò)增的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一套適合于伯樂(lè)樹(shù)種群遺傳多樣性分析的SSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系。

1 方法與材料

1.1 材料

伯樂(lè)樹(shù)葉片采自湖南陽(yáng)明山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)。野外采集的葉片經(jīng)硅膠干燥后，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。SSR-PCR反應(yīng)引物參考文獻(xiàn)[8]，由華大基因公司合成。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選用引物Bl9（F: ACACACACACACAGAGAGAGAG；R:CAACCAAGGAAGCCATTACAAC）作為PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化試驗(yàn)的固定引物。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與檢測(cè)

伯樂(lè)樹(shù)總DNA提取，參考文獻(xiàn)[9]，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，Eppendorf公司Bio Photometer核酸蛋白質(zhì)分析儀測(cè)定濃度與純度。提取的DNA稀釋至60ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)影響SSR-PCR反應(yīng)主要因素（Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA）進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗(yàn)（表1）。當(dāng)一種因素進(jìn)行濃度（用量）梯度變化實(shí)驗(yàn)時(shí)，其它因素的濃度不變，比較不同濃度處理對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響。

表1 SSR-PCR單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Single factor experiments design for SSR-PCR

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的各影響因素的濃度范圍，設(shè)計(jì)5因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2），以確定適合伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系。

表2 SSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2 Orthogonal design for SSR-PCR

1.2.4 退火溫度確定

在試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，設(shè)置6個(gè)退火溫度梯度（53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃）試驗(yàn)，以確定選用引物的最佳退火溫度。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl與等量上樣緩沖液（98%去離子甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青）混勻，于95℃變性5 min后，置冰上冷卻后，取3 μL上樣，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，150 V恒壓。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距底部1 cm時(shí)，停止電泳，銀染[10]，用CanoScan LiDE 100型掃描儀掃描保存。

1.2.6 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

用優(yōu)化的伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR最佳反應(yīng)體系對(duì)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

影響SSR-PCR反應(yīng)5種主要因素6個(gè)不同濃度水平的擴(kuò)增結(jié)果圖1。由圖1可知，Mg2+濃度梯度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物影響顯，隨著Mg2+濃度增大，條帶亮度由暗變亮再變暗。Mg2+濃度為0.625 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶不明顯；濃度范圍為1.25～2.5 mol/L，條帶清晰明亮；濃度范圍為3.125～3.75 mmol/L，條帶模糊。6種dNTP濃度均可擴(kuò)增出產(chǎn)物，但濃度不同，擴(kuò)增條帶的亮度差異明顯。低濃度或高濃度條件下，擴(kuò)增條帶不清晰、模糊，當(dāng)濃度為0.15 mmol/L時(shí)，條帶最為清晰。不同引物濃度的擴(kuò)增結(jié)果差異較小，引物濃度較低（0.1 μmol/L）時(shí)，擴(kuò)增條帶不清晰；引物濃度達(dá)0.2 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶的亮度不隨引物濃度變化而變化。Taq DNA聚合酶為0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰；Taq DNA聚合酶用量大于0.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶有彌散現(xiàn)象出現(xiàn)。模板DNA用量對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增影響不明顯，模板DNA用量為75 ng時(shí)，條帶最清晰。

2.2 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，第11組條帶清晰明亮，穩(wěn)定性好：由此確定伯樂(lè)樹(shù)SSRPCR擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系為。20 μL反應(yīng)體系含有Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，引物0.3 μmol/L，DNA 90 ng。

2.3 退火溫度

不同退火溫度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增影響結(jié)果（圖3）表明，退火溫度范圍為53～55℃，電泳條帶亮度相當(dāng)；退火溫度高于55℃時(shí)，PCR擴(kuò)增的條帶亮度減弱。因此，綜合考慮選擇55℃作為引物Bl9的最適退火溫度。

2.4 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

利用最佳反應(yīng)體系，對(duì)19份伯樂(lè)樹(shù)樣品進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增的結(jié)果（圖4）顯示，所有樣品擴(kuò)增出的目的條帶明亮清晰。這說(shuō)明本研究篩選出的最佳反應(yīng)體系擴(kuò)增穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步開(kāi)展伯樂(lè)樹(shù)SSR遺傳多樣性研究。

圖1 各單因素對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增的影響Fig.1 Effects of each single factor on SSR-PCR

圖2 伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR正交試驗(yàn)電泳Fig.2 Electrophoretogram for SSR-PCR orthogonal design of B.sinensis

圖3 退火溫度對(duì)SSR-PCR的影響Fig.3 Effects of annealing temperature on SSR-PCR

圖4 最佳反應(yīng)體系對(duì)19份伯樂(lè)樹(shù)樣品的SSR-PCR結(jié)果Fig.4 SSR-PCR results of 19 materials by the optimal reaction system

3 結(jié) 論

SSR-PCR反應(yīng)體系涉及到Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA的濃度及退火溫度等諸多影響因素，各種影響因素之間存在交互作用[11]，本研究采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合對(duì)伯樂(lè)樹(shù)SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合于伯樂(lè)樹(shù)的最佳反應(yīng)體系，這為進(jìn)一步開(kāi)展基于SSR標(biāo)記的伯樂(lè)樹(shù)遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of SSR-PCR System for Bretschneidera sinensis

YAN Li-jun1, WANG Hong-xia2, HUANG Fang-fang1, HE Chang-qing1, LIANG Yan1, XU Gang-biao1
(1. School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004; Hunan,China; 2. Planning and Design Institute of Forest Products Industry, Beijing 100010, China)

The main factors affecting SSR-PCR system of Bretschneidera sinensis were optimized through single factor experiments and orthogonal design with the leaves of B. sinensis. An optimal SSR-PCR system for B. sinensis was established, containing 1.25 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTP, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.3 μmol/L primers, 90 ng DNA template. This SSR-PCR system lays a foundation for SSR analysis in B. sinensis.

Bretschneidera sinensis; SSR-PCR; reaction system optimization

S718.46

A

1673-923X(2014)12-0083-04

2014-05-13

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201104033）；十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAC01B07－2）

閆麗君（1989-），女，河南衛(wèi)輝人，碩士研究生，主要從事植物分子群體遺傳學(xué)研究

徐剛標(biāo)（1965-），男，安徽樅陽(yáng)人，教授，主要從事植物種群遺傳與林木遺傳改良研究；E-mail：gangbiaoxu@163.com

[本文編校：吳 彬]