歐陽樂軍，沙月娥，黃真池，李莉梅，曾富華

（1.廣東石油化工學(xué)院，廣東 茂名 525000；2. 湛江師范學(xué)院，廣東 湛江 524048）

尾巨桉不同類型愈傷組織內(nèi)源激素含量差異比較

歐陽樂軍1，沙月娥2，黃真池2，李莉梅1，曾富華2

（1.廣東石油化工學(xué)院，廣東 茂名 525000；2. 湛江師范學(xué)院，廣東 湛江 524048）

本實(shí)驗(yàn)以尾巨桉無性系（DH32-29）無菌苗的莖段為外植體誘導(dǎo)得到的綠色、黃綠色、白色和褐色4種類型愈傷組織為材料。檢測(cè)不同愈傷組織中內(nèi)源激素的含量，結(jié)果顯示，綠色和黃綠色胚性愈傷組織中的IAA、ABA、6-BA含量均比白色和褐色的非胚性愈傷組織高，其中ABA的差異最大，而GA3含量則在非胚性愈傷組織中含量較高。較高含量的GA3不利于胚性愈傷組織的形成，而往培養(yǎng)基中添加適量的ABA可提高尾巨桉胚性愈傷組織的形成率及胚狀體的發(fā)生率。本研究為尾巨桉胚狀體誘導(dǎo)及分化機(jī)理提供借鑒與參考。

尾巨桉 愈傷組織 內(nèi)源激素

尾巨桉是我國種植面積最大的桉樹人工林樹種[1]，其種苗培育一直通過組織培養(yǎng)擴(kuò)繁的方式進(jìn)行，但由于不定芽分化困難，再生效率不高[2]。利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生能增加繁殖系數(shù)，提高種苗質(zhì)量，降低種苗生產(chǎn)成本。加之，尾巨桉胚性細(xì)胞繁殖快，同步性好，具有很強(qiáng)的接受外源DNA的能力，是理想的外源基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。因此，胚狀體誘導(dǎo)在高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、離體種子資源保存等許多方面都有廣泛的應(yīng)用，社會(huì)、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益良好[3]。非胚性愈傷組織（Non-embryonic callus，NEC）細(xì)胞木質(zhì)化程度高，活力不強(qiáng)，難以接受外源基因而轉(zhuǎn)化成功，也難以再生成植株。建立尾巨桉胚性愈傷組織（Embryonic callus，EC）高頻發(fā)生體系是誘導(dǎo)尾巨桉胚狀體發(fā)生的前提。

近年來，在植物胚性細(xì)胞發(fā)育及胚狀體發(fā)生過程的研究上，研究者已不僅僅局限于組織形態(tài)學(xué)上的描述，而是在此基礎(chǔ)上，結(jié)合生理生化的研究，探討體細(xì)胞胚性的啟動(dòng)及胚狀體發(fā)生的生理及分子機(jī)制。胚狀體發(fā)生是體細(xì)胞脫分化進(jìn)而再分化的過程，這個(gè)過程中細(xì)胞內(nèi)源激素含量的變化與胚性愈傷組織分化形成胚狀體有緊密的相關(guān)性[4-7]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中，通過多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合運(yùn)用，成功誘導(dǎo)得到尾巨桉胚性愈傷組織。本研究以尾巨桉胚性與非胚性愈傷組織為材料，通過高效液相法測(cè)定胚性愈傷組織及非胚性愈傷組織內(nèi)源激素含量的差異，可為胚狀體誘導(dǎo)及分化機(jī)理提供借鑒與參考。

1 材料與試劑

1.1 材 料

采用本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)得到的4種不同顏色尾巨桉愈傷組織為材料，其中綠色和淺黃色的高活性的為胚性愈傷組織，白色和褐色為非胚性愈傷組織[8]。

1.2 主要試劑

IAA(生長(zhǎng)素)、GA3(赤霉素)、ABA（脫落酸）、6-BA標(biāo)準(zhǔn)品、PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）均購置上海生工，其他試劑為國產(chǎn)分析純，購置廣州化學(xué)試劑廠。

2 方法

2.1 IAA、GA3、ABA、6-BA標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

分別稱取IAA、GA3、ABA、6-BA標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g，分別配制成 0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液。

2.2 IAA、GA3、ABA的提取、分離及其含量檢測(cè)

2.2.1 IAA、GA3、ABA的提取

分別稱取綠色、淺黃色、白色和褐色尾巨桉愈傷組織材料各2 g，加20 mL 80%預(yù)冷的甲醇研磨，于0℃中浸提21 h（隔一段時(shí)間振蕩一下），接著離心30 min（4℃，9 500 rpm），殘?jiān)? mL80%甲醇洗滌、攪勻，浸提3 h然后離心30 min（4℃，9 500 rpm），殘?jiān)僦貜?fù)浸提及離心的步驟，最后合并3次離心濾液。

2.2.2 IAA、GA3、ABA的分離

上述得到的濾液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃減壓濃縮至水相。將水相在-39℃凍12 h，于4℃下解凍，離心30 min（4℃，11 600 rpm），取上清液，用 0.2 mol·L-1Na2HPO4調(diào) pH 至 8.0，然后用等體積的乙酸乙酯和石油醚萃取3次，合并酯相，同時(shí)合并水相，用2 mL pH8.0磷酸緩沖液將酯相洗滌三次，合并水相，棄去酯相。水相于40℃下濃縮除去殘余酯相，再往水相加入1 g 交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），于5℃低溫?fù)u床中搖30 min，過濾除去PVPP，濾液用1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH至2.8。接著濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，除去水相，酯相于-39℃冰凍過濾除去水分，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干，最后用流動(dòng)相定容至2 mL。

2.2.3 HPLC法檢測(cè)前流動(dòng)相、標(biāo)樣及樣品的前處理

流動(dòng)相中甲醇及0.01 mol·L-1磷酸分別經(jīng)過有機(jī)相濾膜和水系濾膜進(jìn)行抽濾，抽濾結(jié)束后超聲30 min。

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品用0.45 μm孔徑濾膜過濾，用1.5 mL收集瓶收集，用振蕩器震蕩50 s。

2.2.4 HPLC法檢測(cè)IAA、GA3、ABA含量

樣品的檢測(cè)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。色譜分離條件為：流動(dòng)相︰甲醇︰ 0.01 mol·L-1H3PO4=42︰ 58(V ︰ V)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：218 nm、265 nm、210 nm；進(jìn)樣量：15 μL。IAA、GA3、ABA各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和各種愈傷組織樣品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。

2.3 6-BA的提取、分離及其含量檢測(cè)

2.3.1 6-BA的提取

分別稱取綠色、白色、黃色及褐色愈傷組織材料各2 g，提取方法同2.2.1。

2.3.2 6-BA的分離

將得到的濾液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃減壓濃縮至水相。將水相在-39℃凍12 h，然后于4℃下解凍，離心30 min（4℃，11 600 rpm），取上清液。上清液用1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH至3.0，接著用等體積石油醚和乙酸乙酯萃取3次，棄去酯相，水相40℃濃縮除去殘余酯相。往水相加入0.5 g PVPP，于5℃搖床中搖30 min，過濾，除去PVPP，再用 0.2 mol·L-1Na2HPO4調(diào) pH 至 8.0，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，黑暗條件下，酯相于蒸發(fā)皿中60℃水浴蒸干。用流動(dòng)相將殘質(zhì)洗脫下來，定容到2 mL。

2.3.3 HPLC法檢測(cè)前流動(dòng)相、標(biāo)樣及樣品的前處理

流動(dòng)相中甲醇及1%冰醋酸分別經(jīng)過有機(jī)相濾膜和水系濾膜進(jìn)行抽濾，抽濾結(jié)束后于超聲儀中超聲30 min。

不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品用0.45 μm孔徑濾膜過濾后用收集瓶收集，震蕩50 s用作待測(cè)液。

2.3.4 6-BA含量檢測(cè)

樣品的檢測(cè)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。色譜分離條件為：流動(dòng)相︰甲醇︰1%冰醋酸=40︰60(V︰V)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：15 μL。6-BA各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和各種愈傷組織樣品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 IAA、GA3、AB及6-BA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品出峰規(guī)律，找出物質(zhì)峰，確定該物質(zhì)的保留時(shí)間，IAA、GA3、ABA的保留時(shí)間分別為：7.850 2±0.020 9、5.183 2±0.010 5、13.397 2±0.016 5（IAA、GA3、ABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1A、B、C）。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，將所得數(shù)據(jù)繪制IAA、GA3、ABA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，IAA線性方程為y =2E + 08x-95 391(R2=0.999 9)，GA3線性方程為y =1E + 07x +1 993.9(R2=0.999 9)，ABA線性方程為y= 8E + 07x-45 880(R2=0.999 8)。

圖1 0.05 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 0.05 mg·L-1 standard samples

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of standard samples

表明 IAA、GA3、ABA 在 0.006 25 ～ 0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)均與吸收峰面積線性關(guān)系良好。

根據(jù)不同濃度6-BA標(biāo)準(zhǔn)品出峰規(guī)律，找出6-BA物質(zhì)峰，確定6-BA的保留時(shí)間，6-BA的保留時(shí)間為：2.3458±0.0033（6-BA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1D）以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，將所得數(shù)據(jù)繪制6-BA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，6-BA線性方程為y = 5E+07x-174 638(R2=0.993 1)，線性范圍為 0.006 25 ～ 0.1 mg·mL-1。

3.2 樣品中IAA、GA3、ABA含量檢測(cè)

3.2.1 4種愈傷組織IAA含量的比較

4種愈傷組織的IAA色譜圖見圖3，通過色譜圖中IAA物質(zhì)峰面積計(jì)算4種愈傷組織中IAA含量，得到綠色愈傷組織IAA含量最高為714.73 ng·g-1，其次是淺黃色愈傷組織，其IAA含量為622.18 ng·g-1，白色及褐色愈傷組織IAA含量較低，分別為491.03、484.76 ng·g-1（圖4）。由此可看出，胚性愈傷組織比非胚性愈傷組織中IAA含量高。

圖3 IAA在218 nm通道下色圖譜Fig.3 Chromatogram of IAA in 218 nm

圖 4 不同類型愈傷組織中IAA含量差異Fig.4 Difference of IAA content in different types of calli

3.2.2 4種愈傷組織GA3含量的比較

4種愈傷組織的GA3色譜圖見圖5，通過色譜圖中GA3物質(zhì)峰面積計(jì)算4種愈傷組織中GA3含量，發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中褐色愈傷組織GA3含量最高，達(dá)到3.99 mg·g-1，其次是白色愈傷組織，綠色愈傷組織中GA3含量最低，也就是非胚性愈傷組織中GA3含量比胚性愈傷組織中高（圖6所示）。

3.2.3 4種愈傷組織ABA含量的比較

4種愈傷組織的ABA色譜圖見圖7，通過色譜圖中ABA物質(zhì)峰面積計(jì)算4種愈傷組織中ABA含量，發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中ABA水平比IAA水平高，但比GA3水平低得多。其中綠色愈傷組織ABA含量最高，淺黃色愈傷組織中ABA含量是綠色愈傷組織的0.5倍，而褐色愈傷組織中ABA含量最低，不到綠色愈傷組織的1/4，差異達(dá)到極顯著水平。由此可知胚性愈傷組織中ABA含量比非胚性愈傷組織中高（圖8所示）。

圖5 GA3 在210 nm通道下色譜圖Fig.5 Chromatogram of GA3 in 210 nm

圖6 不同類型愈傷組織中GA3含量差異Fig.6 Difference of GA3 content in different types of calli

3.2.4 樣品中6-BA含量測(cè)定

4種愈傷組織的6-BA色譜圖見圖9，圖中顯示，210 nm下白色愈傷組織和褐色愈傷組織樣品的雜峰比較多。通過色譜圖中6-BA物質(zhì)峰面積計(jì)算4種愈傷組織中6-BA含量，發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中6-BA水平比IAA、ABA水平高，但比GA3水平低。其中淺黃色愈傷組織含量最高，其他3種愈傷組織含量相近，但總體來說，胚性愈傷組織中6-BA含量比非胚性中的高（圖10所示）。

圖7 ABA 在265 nm通道下色譜圖Fig.7 Chromatogram of ABA in 265 nm

圖8 不同類型愈傷組織中ABA含量差異Fig.8 Difference of ABA content in different types of calli

4 討 論

胚狀體形成及胚性愈傷組織分化是一個(gè)極為復(fù)雜的生理生化和形態(tài)發(fā)生過程，是植物體內(nèi)各種因素共同作用、相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，期間各類植物激素發(fā)揮不同作用，同時(shí)呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律[9-12]。

本研究檢測(cè)了胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織中內(nèi)源激素含量，通過比較發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織中IAA、ABA含量比非胚性愈傷組織中的高，而GA3則相反。賴鐘雄等[13]在龍眼胚狀體內(nèi)源激素變化的研究中發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中內(nèi)源IAA水平大大高于非胚性愈傷組織，因此其推測(cè)相對(duì)高水平的內(nèi)源IAA含量是誘導(dǎo)和維持胚性細(xì)胞的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與其相類似。

生長(zhǎng)素用于啟動(dòng)細(xì)胞分裂及其胚性潛力的誘導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中IAA含量相對(duì)較高，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)一般被認(rèn)為不是啟動(dòng)胚性必需的，但是在某些植物上，這類物質(zhì)對(duì)其胚狀體的發(fā)生也起著關(guān)鍵的作用，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的適當(dāng)組合能有效誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生。內(nèi)源脫落酸與體細(xì)胞胚性能力的啟動(dòng)或者表達(dá)相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)胚性與非胚性愈傷組織中ABA含量差異較明顯。張媛媛[14]等人的研究表明，ABA在植物體細(xì)胞胚形成期逐漸上升，并且ABA∶IAA相對(duì)比值在此階段仍然處于較高水平，高ABA∶IAA比值有利于體細(xì)胞胚的形成，這與本研究結(jié)論相一致。

愈傷組織中的色素會(huì)干擾激素的檢測(cè)，不同顏色的愈傷組織中含有的色素也不一樣，因此給內(nèi)源激素的檢測(cè)帶來難度[15]。本實(shí)驗(yàn)中利用的脫色劑為石油醚，但是樣品即使研磨得很細(xì)，脫色后仍然有微小的愈傷組織顆粒，結(jié)合在這些小顆粒上的色素難以清除干凈。這可能就導(dǎo)致了在ABA、6-BA檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)很多雜峰。而且愈傷組織中內(nèi)源激素含量與愈傷組織的選擇等外界條件有很大的關(guān)系，同時(shí)也與測(cè)定時(shí)的流動(dòng)相、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)有關(guān)，而且合適的內(nèi)源激素提取方法的選擇和色譜條件也較為重要。對(duì)于尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)中，外源激素處理與內(nèi)源激素含量變化間的相關(guān)性以及愈傷組織分化不同階段中內(nèi)源激素含量變化規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。

圖9 6-BA 在210 nm通道下色譜圖Fig.9 Chromatogram of 6-BA in 210 nm

圖10 不同類型愈傷組織中6-BA含量差異Fig.10 Difference of 6-BA content in different types of calli

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Study on Difference of Callus of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis

OUYANG Le-jun1, SHA Yue-e2, HUANG Zhen-chi2, LI Li-mei1, ZENG Fu-hua2
(1. Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, Guangdong, China; 2. Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048, Guangdong, China)

Hypocotyls excised from Europhylla formed callus.Then later, the callus differentiated into 4 types, including brown callus,green callus, yellowish green and white callus.The levels of endogenous phytohormones were detected by HPLC. The result showed the contents of IAA、ABA and 6-BA in embryogenic calli were higher than those in non-embryogenic calli while the content of GA3was higher in non-embryogenic calli. GA3may deteriorate the capacity of calli to differentiate. The addition of ABA was benef i cial for embryogenic callus induction and somatic embryogenesis. With this work we lay the foundation for the eff i cient somatic embryogenesis in E. urophylla × E. grandis.

Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis; Callus; endogenous phytohormones

S718.46

A

1673-923X(2014)12-0071-07

2013-12-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31470677）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2013040014690，S2012010008737）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A020602108）

歐陽樂軍，男，博士，研究方向?yàn)榱帜窘M織培養(yǎng)與生物技術(shù)研究；E-mail：ljouyang@zhjnc.edu.cn

[本文編校：吳 彬]