高夢婕， 周 瑤， 盛永剛， 趙善貞， 鄧曉軍* ，郭德華， 丁卓平* ， 王國民， 彭 濤

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2. 上海出入境檢驗檢疫局，上海200135；3. 重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020；4. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100123）

雙酚類化合物屬內(nèi)分泌干擾物，對人類和生物有毒害作用［1，2］。雙酚類化合物存在于塑料包裝材料中，在食品的加工運輸貯藏過程中會遷移至食品內(nèi)容物中，進(jìn)而危害人體健康［3-6］。隨著保健食品業(yè)快速發(fā)展，保健食品的日常食用量越來越大，食品接觸包裝材料中雙酚類化合物的遷移對人體的影響越來越受到重視。雙酚A（BPA）及環(huán)氧化物、雙酚F（BPF）及環(huán)氧化物對生殖系統(tǒng)發(fā)育有很大危害，并嚴(yán)重影響胎兒及兒童的大腦發(fā)育［4，5］；雙酚S（BPS）可作為雙酚A 的代用品，同時是醫(yī)用高分子材料及各種塑料的重要原料，具有擾亂生殖系統(tǒng)的危害［6］。

目前，對于雙酚類化合物的遷移限量規(guī)定并不完善。歐盟法規(guī)（EC／1895／2005 號指令）規(guī)定自2006 年1 月1 日以后禁止在食品接觸的涂料中使用雙酚F 二縮水甘油醚（BFDGE），并規(guī)定雙酚A二縮水甘油醚（BADGE）、雙酚A-（2，3-二羥基丙基甘油醚）（BADGE-H2O）、雙酚A-雙（2，3-二羥基丙基醚）（BADGE-2H2O）在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過9 mg／kg，單一各類在食品或食品模擬物中的遷移總量不超過1 mg／kg［7］。同時歐盟塑料法規(guī)［8］和我國國家標(biāo)準(zhǔn)［9］均規(guī)定雙酚S 在食品或食品模擬物中的遷移限量為0.05 mg／kg。

雙酚類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-13］。前者對于復(fù)雜基質(zhì)中痕量殘留物質(zhì)的分析不能提供結(jié)構(gòu)方面的信息，故在實際殘留分析中受到一定限制。對于樣品前處理而言，傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)溶劑使用量大、步驟繁瑣且耗時耗力。而QuEChERS 法具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全等特點［14，15］，適合基質(zhì)復(fù)雜的保健食品。目前，對于雙酚類化合物的檢測僅限于罐頭產(chǎn)品的研究［10-12］，還未見保健食品中同時檢測12 種雙酚類化合物的報道。本文通過改進(jìn)的QuEChERS 法進(jìn)行前處理，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS／MS）同時測定保健食品中12 種雙酚類化合物，操作簡單、耗時短、應(yīng)用前景廣泛。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API 4000 型四極桿串聯(lián)線性質(zhì)譜儀（美國AB公司）；UFLC XR 高效液相色譜儀（日本島津公司）；電子分析天平（精度為0.000 1 g，德國Sartorius ME 公司）；XW-80A 渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Milli-Q 超純水一體機(jī)（Millipore 公司）；NEVAP 氮吹儀（美國Organomation 公司）；Allegia X-22R 高速冷凍離心機(jī)（Beckman 公司）；0. 22 μm有機(jī)相濾膜（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

BPA 和BPF 標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%，日本TCI 公司）；BFDGE 標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；雙酚S 標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，美國Admas公司）；其余8 種雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，瑞士Fluka 公司）。乙腈、甲醇、正己烷（ACS 純，美國Merck 公司）；甲酸、乙酸（ACS 純，J.T. Baker 公司）；乙酸銨（分析純，上海國藥集團(tuán)）；NaCl、無水MgSO4、無水Na2SO4和乙酸鈉（中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司）；CNW-BONDN-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）和高碳C18（HC-C18）粉末（上海安譜公司）；實驗用水為超純水（Millipore系統(tǒng)生產(chǎn)）。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取0.010 0 g 標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，4℃下保存。12 種雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度為1.000 g／L，用甲醇稀釋為10 mg／L 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃避光保存。取空白樣品基質(zhì)按照1.2 節(jié)步驟制備得基質(zhì)空白溶液，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成適當(dāng)濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用時現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

1.2.1 固體粉狀和口服液類保健食品

稱取均質(zhì)樣品2 g，置于50 mL 離心管中，加入適量雙酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液、4 mL 去離子水、7.5 mL 含0.1%（v／v）乙酸乙腈溶液、1.5 g 醋酸鈉和1 g NaCl，超聲混合5 min，以5 000 r／min 離心5 min，收集上清液；基質(zhì)中加入7.5 mL 含0.1% （v／v）乙酸乙腈溶液進(jìn)行二次提取，合并兩次上清液。加入100 mg PSA、50 mg GCB、50 mg HC-C18和1 g 無水Na2SO4，渦漩混合5 min，以5 000 r／min 離心5 min；移取上清液5 mL 至玻璃管中，在40 ℃下氮氣吹干，用1 mL 含0.1% （v／v）甲酸的甲醇-水（50∶50，v／v）復(fù)溶；溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，以10 000 r／min 離心5 min；上清液過0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.2 膠囊類保健食品

稱取膠囊中的內(nèi)容物1 g，置于50 mL 塑料離心管中，加入適量雙酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液、4 mL 乙腈飽和正己烷，渦漩混合3 min，加入5 mL 正己烷飽和乙腈，超聲混合5 min，以5 000 r／min 離心5 min，收集下層清液；基質(zhì)中加入5 mL 正己烷飽和乙腈進(jìn)行二次提取，合并兩次的下層清液。加入100 mg PSA、200 mg HC-C18、1 g 無水Na2SO4，渦漩混合5 min，以4 000 r／min 離心10 min；移取下層清液5 mL 至玻璃管中，在40 ℃下氮氣吹干，用1 mL 含0.1%（v／v）甲酸的甲醇-水（50∶50，v／v）復(fù)溶；溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，以10 000 r／min 離心5 min；上清液過0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.3 實際樣品的測定

實際樣品不加入雙酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不同基質(zhì)的樣品前處理分別按照1.2.1 節(jié)和1.2.2 節(jié)進(jìn)行。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

Thermo Aquasil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）。流動相A 和B 分別為甲醇和0.1% （v／v）甲酸溶液（含0.005 mol／L 醋酸銨）；進(jìn)樣量:10 μL；流速:0.6 mL／min；柱溫:30 ℃。梯度洗脫程序為:0 ～5 min，50% A；5 ～12 min，50% A ～80% A；12 ～19 min，80% A；19 ～21 min，80% A ～50% A；21 ～22 min，50%A。

離子源:電噴霧離子化正離子模式（ESI＋）和負(fù)離子模式（ESI-）；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）:5 500 V；霧化氣壓力（GS1）:413.8 kPa；氣簾氣壓力（CUR）:172.4 kPa；輔助氣壓力（GS2）:413.8 kPa；離子源溫度（TEM）:500℃；碰撞活化解離（CAD）:高（high）。12 種雙酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 測定12 種雙酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of MS／MS for the determination of the 12 bisphenol compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

比較了甲醇-水和乙腈-水流動相中加入一定量的醋酸銨和甲酸等添加劑對目標(biāo)化合物離子化效率的影響。在流動相中加入0.005 mol／L 醋酸銨有助于消除鈉鹽的干擾，而加入0.1%（v／v）甲酸有助于待測物母離子峰的形成［16］。實驗結(jié)果顯示，以甲醇為有機(jī)相時，各待測物響應(yīng)強度較穩(wěn)定，且峰形均較好；而乙腈為有機(jī)相時，響應(yīng)值明顯降低，分離度也不佳，不適合同時檢測。故選用對雙酚類具有較好分離效果的甲醇為有機(jī)相。初始流動相比例為甲醇-水（50∶50，v／v），在10 min 內(nèi)甲醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，可完全洗脫所有雙酚類物質(zhì)，出峰明顯，故洗脫時間設(shè)定為22 min。12 種雙酚類化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取1.0 mg／L 的雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以流動注射的方式在ESI＋和ESI-模式下進(jìn)行電離監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn):BPA 和BPF 在ESI-模式下有更好的響應(yīng)，其余10 種雙酚類化合物在ESI＋模式下有更好的響應(yīng)。再將各物質(zhì)在ESI 模式下進(jìn)行母離子掃描，BPA 和BPF 在一級全掃描質(zhì)譜圖中得到［MH］-，其余10 種雙酚類化合物在一級全掃描質(zhì)譜圖中得到［M ＋NH4］＋；參照國際食品法典委員會（CAC）和EU 657／2002／EEC 號決議中有關(guān)規(guī)定［17］，選擇兩對離子進(jìn)行MRM 監(jiān)測即可，應(yīng)選擇實際樣品分析中基質(zhì)干擾較少的離子對，并考慮每種化合物標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)特性。通過調(diào)節(jié)儀器參數(shù)使母離子的豐度最大，進(jìn)一步對子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子作為定性、定量離子，并優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）等參數(shù)條件，以達(dá)到最佳靈敏度。12 種雙酚類化合物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 12 種雙酚類化合物的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM Chromatograms of the 12 bisphenol compounds

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取液的優(yōu)化

雙酚類化合物的結(jié)構(gòu)中均含兩個及以上的苯環(huán)，易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑。同時，乙腈中加入酸有利于提高雙酚類化合物的提取效率［11］。比較了含不同體積分?jǐn)?shù)（0.1%、1%）的甲酸或乙酸的乙腈溶液對待測物的提取效果。圖2 結(jié)果顯示，采用含1%乙酸的乙腈溶液可從基質(zhì)中充分提取目標(biāo)化合物，故最終選定含1% 乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。

圖2 使用不同溶劑的前處理方法對待測物的回收率Fig.2 Recovery of analytes by various solvents in the process of preparation

2.3.2 凈化劑的優(yōu)化

在處理保健食品的基質(zhì)凈化時，以配方奶粉、口服液和膠囊類為基質(zhì)。QuEChERS 方法的凈化劑種類有很多，不同的凈化劑發(fā)揮不同的作用。PSA主要用于吸附樣品中的糖類和有機(jī)酸等弱酸性成分，GCB 用于去除樣品中的色素，而HC-C18對去除樣品中的蛋白質(zhì)和脂類成分有較好的效果［18，19］。根據(jù)保健食品不同基質(zhì)的特點，比較了PSA、GCB和HC-C18的組合對凈化和回收的影響（見表2）?；|(zhì)為固體粉狀和口服液時，凈化劑最優(yōu)組合為PSA 100 mg、GCB 50 mg、HC-C1850 mg。膠囊類樣品的基質(zhì)中幾乎不含色素，不加入GCB；其干擾主要來自脂肪，需加入HC-C18去除，故凈化劑最優(yōu)組合為PSA 100 mg、HC-C18200 mg。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性范圍與檢出限

選取空白基質(zhì)溶液配制12 種雙酚類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積和對應(yīng)的含量作圖。結(jié)果表明，12 種化合物在0.5 ～50.0 μg／kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99（見表3）。以S／N ＞10 和S／N ＞3 確定12 種雙酚類化合物的定量限（LOQ）及檢出限（LOD）分別為0.4 ～1.7 μg／kg 及0.1 ～0.5 μg／kg，優(yōu) 于 文 獻(xiàn)［11］結(jié) 果（BADGE-HCl、BADGE-2HCl 和BFDGE-2H2O 的LOQ 為2.0 μg／kg）。

表2 凈化步驟中凈化劑組合的優(yōu)化結(jié)果（n ＝6）Table 2 Results of optimal combination of clean-up procedure （n ＝6）

表3 12 種雙酚類化合物的相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限及定量限（n ＝6）Table 3 Correlation coefficients （r），limits of detection （LODs）and limits of quantitation （LOQs）of the 12 bisphenol compounds （n ＝6）

2.4.2 回收率與精密度

選取不含雙酚類化合物的配方奶粉、口服液和魚油膠囊為空白基質(zhì)，添加12 種雙酚類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行低、中、高3 個水平的加標(biāo)回收試驗。每個添加水平各取6 個獨立樣品進(jìn)行處理，考察方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（見表4）。本方法對12 種雙酚類化合物有良好的準(zhǔn)確度與精密度。

最低添加水平（2.0 μg／kg）和空白口服液樣品的MRM 色譜圖見圖3。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行檢測時，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，目標(biāo)化合物發(fā)生離子增強或抑制作用［20］。

采用不含待測化合物的配方奶粉、口服液和魚油膠囊的基質(zhì)空白溶液添加100 μg／kg 的雙酚類化合物，平行進(jìn)樣3 次，按照公式（1）對其峰面積進(jìn)行歸一化:

其中Ax為某基質(zhì)中添加的雙酚類化合物的峰面積，As為雙酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。結(jié)果表明，基質(zhì)抑制率在47.1% ～116.4% 之間，特別是在魚油膠囊和配方奶粉中存在較強的基質(zhì)效應(yīng)，可能是由于化合物競爭離子化造成的［21］。本實驗采用基質(zhì)曲線進(jìn)行定量分析，可以減弱基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法對市售的100 種不同類型的保健食品進(jìn)行測定，12 種雙酚類化合物在膠囊中均未檢出；在配方奶粉、固體飲料和口服液中檢出BPA、BADGE-2H2O、BADGE-2HCl、BFDGE，含量為0.8～29.6 μg／kg。說明雙酚類化合物在有些保健食品的包裝材料中存在，并遷移到食品內(nèi)容物中，但含量相對較低，未超過歐盟對食品中遷移總量的規(guī)定。

圖3 （a）加標(biāo)（2.0 μg／kg）和（b）空白口服液樣品的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of （a）spiked （2.0 μg／kg）and （b）blank oral solution samples

表4 12 種雙酚類化合物的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n ＝6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of the 12 bisphenol compounds （n ＝6）

3 結(jié)論

建立了采用QuEChERS 法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析保健食品中12 種雙酚類化合物的方法，并應(yīng)用于實際樣品的檢測。該方法操作簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、回收率佳，滿足現(xiàn)行法規(guī)要求，可實現(xiàn)保健食品中雙酚類化合物的定性定量，具有實際應(yīng)用價值。

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