范金波，蔡茜彤，馮敘橋，侯宇

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

牛蒡(Arctium lappa L.)俗稱“狗寶”，屬橘梗目，菊科2年生草本植物，牛蒡在溫帶廣泛分布，我國東北、華北、西北地區(qū)，華東、華中、西南部分均有種植［1］。牛蒡根肉質(zhì)肥大，是一種營養(yǎng)保健品，其胡蘿卜素含量比胡蘿卜高150倍，蛋白質(zhì)和鈣的含量為根莖類之首，新鮮牛蒡富含多種多酚化合物，包括綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、槲皮素等［2］。Mikami-Konishide等［3］研究日本的71種果蔬多酚提取物清除氧自由基的能力，發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物清除氧自由基的能力僅次于長果種、紫蘇和空心菜位于第4位。婁在祥［4］利用超聲微波輔助提取牛蒡葉多酚，并鑒定了牛蒡葉的11種活性成分，包括槲皮素、槲皮苷、咖啡酸、綠原酸、蘆丁、苯甲酸等，且研究發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物有著與合成抗氧化劑特丁基對苯二酚(tert-Butylhydroquinone，TBHQ)相近的抗氧化活性。Ku［5］和Liu［6］等報(bào)道牛蒡多酚提取物對于幽門螺桿菌引發(fā)的胃潰瘍有輔助治療作用。

超聲波能夠產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)，并具有強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，能夠造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，從而加速目標(biāo)成分的溶出，在縮短提取時(shí)間的同時(shí)避免了高溫對有效成分的破壞［7］。本研究利用超聲波輔助提取牛蒡多酚，優(yōu)化了牛蒡根黃酮和總酚的提取條件，并探討了牛蒡多酚抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

RRH-A500高速多功能粉碎機(jī)，上海緣沃工貿(mào)有限公司;UV-2700紫外-可見光分光光度計(jì)，日本SHIMADZU公司;JA5003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;Centrifuge5804-R冷凍離心機(jī)，德國eppendorf公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司。

牛蒡，徐州大自然公司提供;蘆丁和沒食子酸，北京百靈威科技有限公司;Folin-Ciocalteu試劑，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;NaNO2、無水乙醇、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛蒡預(yù)處理

將新鮮牛蒡根清洗切片，并于0.5%抗壞血酸溶液中浸泡30min［8］，瀝干切碎后，40℃熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎，過60篩，制得牛蒡干粉，低溫凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 提取溫度對牛蒡多酚得率的影響

選取提取溫度分別 30、40、50、60、70、80℃，在體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、提取時(shí)間為30 min、超聲功率200 W，料液比為1∶20(g∶mL)條件下，研究提取溫度對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對牛蒡多酚得率的影響

分別選用體積分?jǐn)?shù)0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇作為溶劑，在提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶20(g∶mL)、超聲功率 200 W、提取溫度 40℃條件下，研究乙醇濃度對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.3 料液比對牛蒡多酚得率的影響

選取料液比1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28(g∶mL)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間30 min、超聲功率200 W條件下，研究料液比對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間對牛蒡多酚得率的影響

選擇提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶20(g∶mL)、超聲功率200 W條件下，考察不同提取時(shí)間對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比和超聲時(shí)間為3個(gè)考察因素，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，選3個(gè)中心點(diǎn)進(jìn)行15個(gè)試驗(yàn)，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，建立二次響應(yīng)回歸模型，擬合得到二次回歸方程。

1.3 總酚與黃酮含量測定

1.3.1 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法測定［9］。以沒食子酸為標(biāo)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到吸光度與總酚質(zhì)量濃度的方程為:y=0.004 35x+0.000 9(R2=0.998 9)。

取1 mL牛蒡提取液加入25 mL比色管中，依次加入福林-酚試劑0.2 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%Na2CO3溶液2 mL，80%乙醇定容，室溫下靜置60 min，于765 nm下測定吸光度，測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得比色管中牛蒡總酚質(zhì)量濃度，并計(jì)算牛蒡總酚得率。

式中:c為比色管中牛蒡總酚濃度(μg/mL);V1為比色管量程(25 mL);V2為反應(yīng)體系中牛蒡提取液體積(1 mL);V為總酚提取液總體積(mL);m為牛蒡粉質(zhì)量(g)。

1.3.2 黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用 NaNO2-Al(NO3)3法測定［10］。以蘆丁為標(biāo)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的方程為:y=0.013 1x-0.000 1(R2=0.998 7)。

取1 mL牛蒡提取液加入25 mL比色管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al(NO3)3溶液0.4 mL搖勻，靜置6 min，最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液4.0 mL，體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至刻度，室溫靜置15 min，測定509 nm處吸光值，并將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得比色管中牛蒡黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算牛蒡黃酮得率。

式中:c為比色管中牛蒡黃酮濃度(μg/mL);V1為比色管量程(25 mL);V2為反應(yīng)體系中牛蒡提取液體積(1 mL);V為黃酮提取液總體積(mL);m為牛蒡粉質(zhì)量(g)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)測定3次，各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5軟件處理作圖，利用Design-Expert 8.0.6軟件中(ANOVA)進(jìn)行方差分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異，P＜0.01認(rèn)為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對牛蒡總酚及黃酮得率的影響

由圖1可知，隨著提取溫度的增高，牛蒡總酚和黃酮得率均呈先增加后降低趨勢，30～40℃內(nèi)，總酚和黃酮得率均急速增加，當(dāng)溫度大于40℃時(shí)，總酚得率隨溫度的增加而降低，這是因?yàn)闇囟冗^高破壞了多酚成分所致［11］;而黃酮得率在40～70℃內(nèi)增加緩慢，當(dāng)溫度繼續(xù)增高，黃酮得率降低。綜上從成本和處理難易程度確定牛蒡多酚最適提取溫度選40℃。

圖1 提取溫度對牛蒡總酚及黃酮得率的影響Fig.1 The effect of temperature on extraction rate of polyphenols in burdock

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對牛蒡總酚及黃酮得率的影響

以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取溶劑，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對牛蒡總酚及黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，牛蒡總酚和黃酮提取率均呈現(xiàn)先增加后急速降低趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，總酚得率已趨于最高水平，而黃酮在80%時(shí)得率最高;相比之下，乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮得率影響更為顯著。已有研究表明，植物體中的黃酮類化合物主要以苷類和苷元的形式存在，黃酮苷大多易溶于乙醇和水等溶劑，黃酮苷元一般難溶或不溶于水，易溶于乙醇，體積分?jǐn)?shù)低的乙醇黃酮提取率也低的結(jié)果說明，牛蒡中黃酮苷元較黃酮苷類更為豐富［12］，綜合二者確定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對牛蒡總酚(a)及黃酮得率(b)的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols in burdock

2.1.3 料液比對牛蒡總酚及黃酮得率的影響

如圖3所示，總酚得率隨著料液比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，而黃酮得率先增加后趨于水平，這可能是因?yàn)槿軇┡c原料的比例越大，濃度差就越大，從而促進(jìn)傳質(zhì)過程，但比例過大時(shí)，超聲波產(chǎn)生的效應(yīng)不再明顯，導(dǎo)致多酚得率不再增加甚至降低［13］。二者在料液比1∶20(g∶mL)時(shí)均達(dá)到最大值，由此確定牛蒡多酚最適提取料液比應(yīng)為1∶20(g∶mL)。

圖3 料液比對牛蒡總酚(a)及黃酮得率(b)的影響Fig.3 Effects of liquid ratio on extraction rate of polyphenols in burdock

2.1.4 提取時(shí)間對牛蒡總酚及黃酮得率的影響

由圖4可知，總酚和黃酮得率與提取時(shí)間的關(guān)系呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，且均在提取時(shí)間30 min時(shí)達(dá)到最大值，由此確定最適提取時(shí)間應(yīng)為30 min。細(xì)胞破裂、多酚物質(zhì)的溶出需要時(shí)間，隨著提取時(shí)間的延長，多酚類物質(zhì)能被充分提取，但時(shí)間過長，多酚物質(zhì)可能被超聲波巨大的機(jī)械能所破壞，從而使得得率下降［14］。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡多酚提取工藝結(jié)果分析

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合試驗(yàn)設(shè)備條件選取乙醇體積分?jǐn)?shù)X1(%)、料液比X2(g∶mL)、超聲溫度X3(℃)為牛蒡多酚提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素，固定超聲功率為200 W。實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

圖4 超聲時(shí)間對牛蒡總酚(a)及黃酮得率(b)的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on extraction rate of polyphenols in burdock

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，獲得超聲波輔助提取牛蒡總酚得率(Y1)和黃酮得率(Y2)對乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、料液比(X2)、超聲溫度(X3)的二次回歸模型方程分別為:

表2 Design-Expert實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design-Expert design scheme and experimental results

對此模型進(jìn)行回歸分析，總酚和黃酮的分析結(jié)果如表3和表4所示。

表3 總酚方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)

表4 黃酮方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)

由表3可得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型整體呈極顯著水平(P＜0.01)，失擬不顯著(P＞0.05)。乙醇濃度、料液比和二次項(xiàng)對總酚得率的影響呈極顯著水平，而超聲溫度對總酚得率影響不顯著。回歸方差分析結(jié)果表明，該模型相關(guān)系數(shù)為R2=0.992 3，模型校正相關(guān)系數(shù)，說明此模型可以解釋97.83%響應(yīng)值的變化。變異系數(shù)(CV%)為2.3%，較小，說明試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。由于超聲溫度(X3)對總酚得率無顯著影響，固定超聲溫度為40℃，可得到乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的變化對牛蒡總酚得率影響的響應(yīng)面分析圖(見圖5)。等高線圖同一曲線上總酚得率相同，圖形中心多酚得率最高，等高線圖沿某一因素軸方向曲線密度越大，說明總酚得率對該因素的變化越敏感，反映在響應(yīng)面上則是曲面坡度越陡峭，等高線形狀趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大，則交互作用越明顯［15］。如圖5所示的響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，有極高值，乙醇濃度和料液比方向的曲面坡度陡峭，說明總酚得率對這兩個(gè)因素的變化敏感，與表3中參數(shù)估計(jì)相吻合。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)料液比(X2)對總酚得率的影響Fig.5 The effect of ethanol concentration and solid liquid ratio on the extration rate of flavonoids

由表4可得實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型整體呈極顯著水平(P＜0.01)，失擬不顯著(P＞0.05)。乙醇濃度對黃酮得率影響顯著，料液比對黃酮得率影響極顯著，超聲溫度對黃酮得率影響不顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用、乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)及料液比的二次項(xiàng)均呈極顯著水平。模型校正相關(guān)系數(shù)為，變異系數(shù)(CV%)為3.4%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。

乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用響應(yīng)面和等高線分析圖如圖6所示。響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面，有極高值，在一定范圍內(nèi)，黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的增加而增高，兩者有顯著交互作用。料液比較乙醇體積分?jǐn)?shù)方向的曲面更陡峭，說明料液比對黃酮得率影響更顯著，與方差分析表一致。

圖6 乙醇濃度(X1)-料液比(X2)對黃酮得率的影響Fig.6 The effect of ethanol concentration-solid and liquid ratio on theflavonoid extration rate

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由軟件分析得，最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.86%、料液比1∶20.52、超聲溫度20℃，在此最優(yōu)條件下總酚得率為47.29 mg/g，黃酮得率為20.94 mg/g。結(jié)合實(shí)際操作，確定提取條件為:超聲功率200 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)61%、料液比1∶21、超聲溫度為室溫，超聲時(shí)間30 min，采取該工藝得到牛蒡總酚得率為47.12 mg/g，牛蒡黃酮得率為20.69 mg/g。與理論值相比相對誤差分別為0.36%和1.19%，說明Design-Expert軟件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對超聲波輔助提取牛蒡多酚工藝參數(shù)進(jìn)行的優(yōu)化有效。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取牛蒡多酚的提取工藝，結(jié)合實(shí)際操作確定最佳試驗(yàn)條件為超聲時(shí)間30 min、超聲功率200 W、提取溫度為室溫、乙醇濃度為61%、料液比1∶21，總酚和黃酮預(yù)測得率分別為47.44 mg/g和20.92 mg/g，采用該工藝條件，牛蒡總酚得率為47.12 mg/g，牛蒡黃酮得率為20.69 mg/g。結(jié)果說明牛蒡根是總酚和黃酮提取的良好原料，具有較好的開發(fā)潛力。

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