蘆夏霏，劉畢琴，柳陳堅，李曉然，羅義勇

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明，650500)

乳酸菌(LAB)是一類可發(fā)酵碳水化合物，并產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要菌群，長期定居于人類腸道中并且益于人體健康，被公認(rèn)為食品級安全的微生物。苯乳酸(PLA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抑菌性的新型生物防腐劑，不僅能有效抑制革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的生長，對真菌同樣具有抑制作用［1］。目前，市場上的食品防腐劑種類繁多，按來源可分為化學(xué)防腐劑和天然防腐劑兩大類。天然防腐劑具有較高的安全性，是防腐劑未來的發(fā)展趨勢。PLA作為一種新型的生物防腐劑可由LAB發(fā)酵產(chǎn)生，由于LAB是公認(rèn)的食品級安全微生物，所以來源于LAB的PLA對人和動物細(xì)胞無毒害［2-3］，可以視為食品級安全的天然防腐劑。一般來說，PLA的產(chǎn)量主要取決于微生物的遺傳特性，研究LAB高產(chǎn)PLA的分子機(jī)制以及通過代謝工程或基因工程手段改造實驗菌株是獲得大量PLA的前體條件。因此，本文綜述了LAB PLA的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制，旨在為PLA的高水平生產(chǎn)以及工業(yè)化利用提供理論支撐。

1 LAB PLA生物合成的核心途徑

在生物合成途徑發(fā)現(xiàn)以前，PLA多以化學(xué)合成為主。由于化學(xué)合成法存在副產(chǎn)物多、排放污染物多、設(shè)備要求高和合成技術(shù)復(fù)雜等缺點［1］，所以近年來，PLA的生物合成途徑，特別是來源于LAB的生物合成途徑受到了越來越多的關(guān)注。

Lavermicocca等［4］從酸面團(tuán)中分離到植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)21B和20B，其代謝產(chǎn)物具有抑菌性。進(jìn)一步研究證實，PLA是賦予該抑菌性的主要原因，這是關(guān)于LAB產(chǎn)生PLA的首次報道。隨后，越來越多能產(chǎn)生PLA的LAB菌株相繼被研究人員發(fā)現(xiàn)［5-6］。李興峰等［7］研究了 Lb.sp.SK007 利用苯丙氨酸(Phe)合成PLA的過程，發(fā)現(xiàn)LAB首先通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)將Phe轉(zhuǎn)化成苯丙酮酸(PPA)，然后PPA經(jīng)還原反應(yīng)生成PLA。以Lb.plantarum LY-78為研究對象，李士龍等［7］也證實了“Phe→PPA→PLA”途徑是LAB PLA生物合成核心途徑的重要組成部分。此外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸也是LAB PLA生物合成核心途徑的一部分。同樣以Lb.sp.SK007為實驗材料，李興峰等［8］對影響PLA合成途徑中轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的因素進(jìn)行研究，確定氨基受體α-酮戊二酸是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的主要影響因素，只有Phe和α-酮戊二酸共同作用才可完成轉(zhuǎn)氨反應(yīng)。相似的發(fā)現(xiàn)存在于 Pudik和 Lolkema［9］的研究中，即 α-酮戊二酸是LAB PLA合成的關(guān)鍵因素，較高濃度的α-酮戊二酸有助于PLA的生成。所以，LAB PLA生物合成的核心途徑是指LAB發(fā)酵Phe和α-酮戊二酸生成PLA的過程(圖1 A)。

2 LAB PLA生物合成的相關(guān)途徑

LAB PLA主要由Phe的代謝生成，除此之外還有一些其他的合成相關(guān)途徑(圖1 B)。劉鳳麗和江波［10］在關(guān)于Lb.sp.SK007生物合成PLA的研究中，發(fā)現(xiàn)PPA在脫羧酶的作用下可以生成苯乙醛，苯乙醛在脫氫酶的作用下也可以生成PLA。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫，對已知全基因組序列的Lb.plantarum WCFS1、JDM1和ST-III［11］進(jìn)行PLA相關(guān)的代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)酪氨酸經(jīng)脫羧酶作用生成酪胺，酪胺可以在單胺氧化酶的作用下生成苯乙醛(圖1B)，所以酪氨酸代謝可能通過苯乙醛這個節(jié)點對PLA代謝有一定影響。Gummalla和 Broadbent［12］為了確定 Lactobacillus代謝 Phe 對干酪風(fēng)味的影響，利用色譜技術(shù)分析了Phe的代謝產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLA、苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸是Phe的主要代謝產(chǎn)物。苯乙醛和苯乙酸有共同的代謝產(chǎn)物苯乙醇，所以“苯乙酸→苯乙醛→苯乙醇”是LAB PLA生物合成的相關(guān)途徑之一。此外，基于α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途徑不可或缺的部分［8-9］以及α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)(TCA)中的重要物質(zhì)之一的背景知識，可以推測TCA途徑對PLA的合成會產(chǎn)生一定的影響，所以TCA應(yīng)該也是PLA生物合成的相關(guān)途徑之一(圖1 B)。

3 LAB PLA的分解代謝途徑

LAB PLA產(chǎn)量的多少除了跟生物合成途徑相關(guān)外，分解代謝同樣具有重要影響。目前，關(guān)于LAB PLA分解代謝途徑的研究較少，且缺乏系統(tǒng)性的研究。李遠(yuǎn)頌等［1］發(fā)現(xiàn)，PLA除了可以代謝為非蛋白氨基酸施德定(一種很有效的胃蛋白酶抑制劑)外，還可以直接轉(zhuǎn)化為1-溴-2，3苯甲烷，再轉(zhuǎn)化為2-苯基雙氫苯并吡喃，最后轉(zhuǎn)化為四氫噻唑二酮衍生物(圖1 C)。另外，利用物理化學(xué)和色譜等分析方法，Wegst和Tittmann［13］在添加 Phe的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分離和鑒定出了一種新的代謝產(chǎn)物——二氫化二醇，說明Lactobacillus可以將PLA轉(zhuǎn)化為二氫化二醇(圖1 C)。此外，利用生物信息學(xué)方法對KEGG數(shù)據(jù)庫分析［14］得出苯乳酸還可以轉(zhuǎn)化為苯乳酸CoA，而苯乳酸CoA還可以進(jìn)一步降解為苯基甘氨酸和苯基谷氨酸2種物質(zhì)(圖1 C)。

圖1 LAB PLA的代謝相關(guān)途徑Figure 1 Metabolism related way of LAB PLA

4 LAB PLA代謝的調(diào)控研究

環(huán)境因素會對PLA的產(chǎn)生造成影響，在相同環(huán)境因素下，有些微生物產(chǎn)PLA的能力很強(qiáng)，而主要的合成途徑基因在DNA水平?jīng)]變化，這可能與PLA合成過程中存在著各種各樣的調(diào)控相關(guān)。

4.1 影響PLA代謝過程的因素

4.1.1 溫度和pH值

為了探究溫度對LAB產(chǎn)PLA的影響，李興峰等［8］測定了Lb.sp.SK007在不同溫度下的生長量和PLA產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30℃是Lb.sp.SK007最適生長溫度，PLA產(chǎn)量也最高。25℃菌體生長緩慢，37℃和43℃時菌體生長和PLA合成均受到抑制。相似的實驗結(jié)果存在于李遠(yuǎn)頌等［1］的研究中，即30℃是LAB菌體生長和PLA合成的最佳溫度。

每種微生物都有適合其生長和代謝物產(chǎn)量的最適pH。李興峰等［15］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基初始 pH在6.0～6.5時，Lb.sp.SK007的PLA產(chǎn)量最佳。王立梅［16］等在研究pH及底物濃度對副干酪乳桿菌(Lb.paracasei)產(chǎn)PLA的影響時，發(fā)現(xiàn)相似的實驗結(jié)果，即發(fā)酵液pH在6.5時PLA產(chǎn)量最高。

4.1.2 培養(yǎng)方式

培養(yǎng)方式是影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化的另外一個重要因素。李興峰等［8，15］分別選取靜置發(fā)酵和振蕩培養(yǎng)2種方式對Lb.sp.SK007產(chǎn)PLA水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在實驗室搖瓶條件下，振蕩培養(yǎng)對菌體生長和PLA合成均不利，并且隨著轉(zhuǎn)速的增加，副產(chǎn)物也隨之增加，說明在振蕩培養(yǎng)條件下，可能是由于底物對氧氣不穩(wěn)定，部分PPA經(jīng)脫羧反應(yīng)產(chǎn)生了苯甲醛;而靜置發(fā)酵更適合菌體生長［15］。由此可見，在發(fā)酵過程中應(yīng)該選擇靜置培養(yǎng)，這樣才會避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生，為PLA的分離純化減輕壓力，使PLA的產(chǎn)量達(dá)到較高水平。

4.2 調(diào)控LAB PLA產(chǎn)生的關(guān)鍵因素

4.2.1 苯丙酮酸(PPA)和α-酮戊二酸的濃度

李興峰和江波［8］研究了Lb.sp.SK007 PPA的代謝途徑及其對PLA合成的影響，發(fā)現(xiàn)在30℃靜止培養(yǎng)情況下，隨著PPA濃度的增加，PLA的產(chǎn)量逐漸增加，達(dá)到18.3 mmol/L的頂峰后，PLA的產(chǎn)量逐漸下降，說明PPA的濃度在一定范圍內(nèi)對PLA的合成具有促進(jìn)作用。α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途徑的一部分(圖1 A)，所以α-酮戊二酸濃度對PLA的合成有重要影響。Pudik和Lolkema［9］發(fā)現(xiàn)增加α-酮戊二酸濃度能顯著提高PLA產(chǎn)量，Phe首先需要與 α-酮戊二酸結(jié)合后，才可被氨基轉(zhuǎn)移酶(ATase)作用;而α-酮戊二酸與Phe的結(jié)合需要轉(zhuǎn)運子CitP的作用。此外，α-酮戊二酸是TCA中的重要代謝終產(chǎn)物之一，所以CitP和TCA對LAB PLA產(chǎn)量應(yīng)該具有間接調(diào)控作用。

4.2.2 乳酸脫氫酶(LDH)

LDH是LAB轉(zhuǎn)化PPA生成PLA的一種關(guān)鍵酶?；蚪M序列分析發(fā)現(xiàn)，Lb.plantarum WCFS1具有3個LDH基因，其中1個為 ldhD，另外2個分別為ldhL1 和 ldhL2［17］。Mehemit等［18］分別研究了糞腸球菌(Enterococcus faecalis)ldhL1和ldhL2的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)在PLA高產(chǎn)菌株中，ldhL1的表達(dá)水平也高，而ldhL2基因缺失菌株的PLA產(chǎn)量基本不受影響。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在賈江花和江波［7］的實驗中:通過E.coli異源表達(dá)和純化，發(fā)現(xiàn)重組酶D-LDH對底物PPA的活性最高，其次為L1-LDH，而L2-LDH幾乎沒有活力，說明D-LDH和L1-LDH是負(fù)責(zé)LAB PLA生物合成的主要LDH。

4.2.3 氨基轉(zhuǎn)移酶(ATase)

Tokuda等［19］指出，ATase 主要作用 Phe，使 Phe轉(zhuǎn)化為 PPA。以 Lb.sp.SK007為實驗材料，Liu等［20］研究了Phe生成PLA過程，發(fā)現(xiàn)在最初的24 h中，Phe減少非常緩慢，并且PLA緩慢增加，檢測不到中間產(chǎn)物PPA;培養(yǎng)72 h后，PLA濃度達(dá)到最高，但Phe仍剩余94%，表明只有6%的Phe發(fā)生了轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，而生成的PPA迅速轉(zhuǎn)化為PLA。因此，由ATase介導(dǎo)的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是Phe生成PLA的限速步驟，對PLA從Phe合成途徑具有重要影響。此外，Phe轉(zhuǎn)化為PPA效率不高的另外一個原因可能是由于該反應(yīng)具有可逆性造成的。LI等［21］發(fā)現(xiàn)用 PPA取代 Phe作為底物，可以顯著提高Lactobacillus PLA的產(chǎn)量，同時發(fā)現(xiàn)在PPA到PLA的轉(zhuǎn)化過程中有少量Phe出現(xiàn)，說明一些PPA在ATase作用下可以轉(zhuǎn)化為Phe。Chambellon等［22］從 Lactococcus lactis分離出，2 個氨基轉(zhuǎn)移酶AraT和BcaT，它們分別負(fù)責(zé)芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用，并且證明araT和bcaT是codY調(diào)節(jié)子的一部分，由營養(yǎng)因子調(diào)控。

4.3 調(diào)控LAB PLA產(chǎn)生的其他因素

據(jù)報道，Phe不是十分穩(wěn)定的，易分解為苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸等代謝產(chǎn)物(圖1 B)，并且苯乙酸還可以轉(zhuǎn)化為苯乙醇［12，19］。由于Phe經(jīng)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生產(chǎn)PPA的低效性［20］，所以由Phe經(jīng)PPA生成PLA的反應(yīng)過程應(yīng)該不是Phe代謝的主要途徑。PLA除了可以由PPA在LDH作用下直接生成外(圖1 A)，還可以經(jīng)“PPA→苯乙醛→PLA”途徑間接產(chǎn)生(圖1 B)。代謝學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)，苯乙醛可以還原為苯乙醇(圖1 B)。這樣通過苯乙醇這個點就可以將Phe代謝、PPA代謝和PLA合成聯(lián)系起來(圖1)，在這個復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)中，各種化合物相互聯(lián)系又相互抑制，因此LAB PLA的產(chǎn)生應(yīng)該會受到這些化合物濃度的調(diào)控。

5 總結(jié)與展望

LAB PLA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型食品級安全防腐劑，具有很廣的抑菌譜。目前，關(guān)于LAB PLA的研究以抑菌性和生產(chǎn)條件的優(yōu)化為主，對于PLA的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的研究相對較少，且主要集中在核心合成途徑以及核心合成途徑相關(guān)酶類對于PLA代謝的影響等方面。

在前期的研究中，我們從云南傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品——豆豉中分離鑒定了1株益生效果較好的Lb.plantarum YM-5-2。抑菌性研究發(fā)現(xiàn)，Lb.plantarum YM-5-2發(fā)酵上清液對大腸桿菌(E.coli)O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等主要食源性病原菌具有很好的抑菌效果［23］。利用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析發(fā)現(xiàn)，Lb.plantarum YM-5-2發(fā)酵上清液中的主要化合物是PLA，且在沒有任何發(fā)酵條件優(yōu)化的條件下，PLA的產(chǎn)量高達(dá)147.91 mg/L［23］。目前，我們利用焦磷酸測序策略測定了Lb.plantarum YM-5-2的全基因組序列(結(jié)果未顯示)，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該菌種具有合成 PLA的關(guān)鍵基因(LDH、ATase等)。探討Lb.plantarum YM-5-2高產(chǎn)PLA的分子機(jī)制是我們接下來要解決的問題。本文對LAB PLA的生物合成和分解代謝途徑以及與該途徑相關(guān)的調(diào)控機(jī)制做了一個系統(tǒng)性的歸類和總結(jié)，不僅可以加深對PLA的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制的理解，同時也可為食品級PLA的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

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