李湘利，劉靜，燕偉，朱九濱

(濟寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜，273155)

芡實(Euryale ferox)俗稱“雞頭米”，為睡蓮科(Nymphaeaceae)芡屬(Euryale ferox Salisb)水生草本植物［1］。芡實蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸種類齊全，維生素含量較豐富;碳水化合物含量高達77% ～78%，除6%左右為不溶性纖維素外，多數(shù)可被消化吸收，是理想的膳食纖維源［2-4］。芡實具有養(yǎng)血安神、去濕健脾、益腎固精、止瀉止滯等功效［5］，對慢性腹瀉、白帶崩下、小便失禁、腰腿關(guān)節(jié)痛等癥有治療作用［6-7］。

多糖是傳統(tǒng)中藥的主要活性成分，具有清除自由基、調(diào)節(jié)代謝的作用［8］。目前，多糖生物活性研究多集中于免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性［9-10］。多糖對各類微生物的生長均有不同程度抑制或拮抗作用，無毒副作用，是純天然食品防腐劑［11］。近年來，芡實多糖提取工藝的研究取得了一定進展［12-13］，但關(guān)于芡實多糖體外抗氧化性及抑菌特性尚缺乏系統(tǒng)研究。為此，本實驗對微波輔助酶法提取芡實多糖的自由基清除作用、抗油脂氧化作用及抑菌特性進行了研究，旨在為芡實多糖的生產(chǎn)與醫(yī)藥應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡實，購于濟寧市微山湖特產(chǎn)批發(fā)零售中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，由本校微生物學(xué)實驗室提供;Na2HPO4、NaH2PO4、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、FeCl3、DPPH、FeSO4、H2O2、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、Vc，均為分析純;蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、瓊脂為生物試劑。

FA2004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;FCD2000恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上?，槴\實驗設(shè)備有限公司;723PC分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司;TD6低速離心機，長沙英泰儀器有限公司;SA300生物顯微鏡，北京泰克儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芡實多糖的提取

芡實于60℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，用乙酸乙酯脫脂并揮干溶媒;按料液比1∶30(g∶mL)加入蒸餾水，添加 α-淀粉酶進行酶解(α-淀粉酶添加量0.5%、pH 6.0、酶解溫度80℃、酶解20 min)，采用微波輔助提取(微波功率550 W、時間4 min);用Sevage法除蛋白［14］，4 000 r/min 離心20 min，加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇沉淀多糖，4℃靜置12 h［14］，再經(jīng)4 000 r/min離心20 min、60℃干燥即得芡實粗多糖。

1.2.2 芡實多糖的清除自由基實驗

1.2.2.1 總還原能力的測定

參照文獻［15］。取1 mL不同濃度的K3Fe(CN)6溶液于10 mL試管中，加入0.2 mol/L的pH 6.6磷酸緩沖液2.5 mL和1.0%的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，50℃水浴20 min，冷卻后加入10 g/100 mL三氯乙酸溶液1 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%FeCl3溶液0.5 mL和蒸餾水2 mL，靜置5 min后于700 nm處測吸光值，以Vc作對照。

1.2.2.2 對O2-·的清除能力測定

參照文獻［16］的方法改進。移取0.05 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL于10 mL試管中，25℃水浴15 min，再加入1 mL不同濃度的芡實多糖溶液和0.5 mL經(jīng)25℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚溶液，25℃水浴5 min;加入2滴8 mmol/L HCl終止反應(yīng)，于420 nm處測定吸光值A(chǔ)1，同時測以蒸餾水代替芡實多糖溶液的反應(yīng)液吸光值A(chǔ)0，以Vc為對照。計算芡實多糖對O2-·的清除率:

清除率/%= ［(A0-A1)/A0］×100

1.2.2.3 對·OH的清除能力測定

按照文獻［17］的方法略作調(diào)整。移取6 mmol/L FeSO4溶液2 mL于10 mL試管中，加入6 mmol/L H2O22 mL及6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，37℃水浴15 min，冷卻，于510 nm測定吸光值 A0;然后加入1 mL不同濃度的芡實多糖溶液，37℃水浴15 min，在510 nm測定吸光值A(chǔ)1，同時以Vc作對照。計算芡實多糖對·OH的清除率:

清除率/%= ［(A0-A1)/A0］×100

1.2.2.4 對DPPH的清除能力測定

按文獻［18］的方法測定。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，移取1 mL不同濃度的芡實多糖溶液于10 mL試管中，加入2 mL蒸餾水和2 mL DPPH溶液，搖勻后室溫放置20 min，于517 nm測吸光值A(chǔ)1，測定上述相同體積的蒸餾水和DPPH溶液混勻后的吸光值A(chǔ)2，測定1 mL樣品溶液和1 mL蒸餾水與2 mL無水乙醇混勻后的吸光值A(chǔ)3，同時以Vc作對照。計算芡實多糖對DPPH·的清除能力:

清除率/%=［1-(A1-A3)/A2］×100

1.2.3 芡實多糖抗油脂氧化實驗

以空白油脂為對照，與芡實多糖和Vc處理的油脂對比，采用烘箱強化法［19］。稱取新制豬油、芝麻油各20.0 g，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%芡實多糖，混勻后于65℃烘箱中強化保存，每隔24 h攪拌5 min并交換試樣在烘箱中的位置，定期測定油脂過氧化值(POV)，POV測定參照GB/T 5538-2005的碘量法。用POV表示油脂的氧化速度，進而衡量抗氧化活性。

1.2.4 芡實多糖體外抑菌特性研究

1.2.4.1 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基:牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 ～20 g、蛋白胨10 g、水 1 000 mL，pH 7.0 ～7.2，121 ℃滅菌20 min［20］;酵母菌培養(yǎng)基:葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、酵母膏10 g、瓊脂15 ～20 g、水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min［20］。

1.2.4.2 菌種活化與菌懸液制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌接種到細菌培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h;釀酒酵母接種到酵母菌培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h。長出菌落后，各挑取1環(huán)活化好的菌種放入9 mL無菌生理鹽水中，振蕩搖勻得菌懸液，濃度約為 106～108CFU/mL，備用［20］。

1.2.4.3 抑菌圈實驗

將定性濾紙制成9 mm圓形濾紙片，121℃滅菌20 min。將芡實多糖配成濃度為 2、4、6、8、10 mg/mL的溶液，無菌濾紙片于多糖溶液浸泡30 min［11］。取供試菌懸液0.5 mL加至倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂勻;浸泡過芡實多糖的濾紙片緊貼于含菌平板上，每平板貼3片，之間留有間隙;以浸泡無菌水的濾紙片為對照，細菌于37℃倒置培養(yǎng)48 h，酵母菌28℃倒置培養(yǎng)72 h后測量抑菌圈直徑，出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的芡實多糖濃度即為最小抑菌濃度［20-21］。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用Microsoft Excel 2003的FORECAST函數(shù)計算清除50%自由基所需芡實多糖濃度(IC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芡實多糖清除自由基實驗結(jié)果

2.1.1 芡實多糖的總還原能力

抗氧化劑通過自身還原給出電子，從而清除自由基;還原能力越強，抗氧化性越強［22］。由圖1可知，在0.2～1.0 mg/mL內(nèi)，芡實多糖經(jīng)反應(yīng)后均出現(xiàn)吸收峰，表明芡實多糖具有一定的還原能力;隨多糖濃度增加，吸光值增大;當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時，芡實多糖吸光度值為0.358。但芡實多糖總還原能力明顯低于同濃度的Vc總還原能力(P＜0.05)。

2.1.2 芡實多糖對O2-·的清除能力

O2-·是生物體內(nèi)首個氧自由基，是其他活性氧的前體，對生物細胞、酶、DNA和不飽和脂肪酸等均有影響［11］。由圖2可知，0.2～1.0 mg/mL的芡實多糖對O2-·有一定的清除作用，清除能力與樣品濃度呈正相關(guān)，芡實多糖濃度為1.0 mg/mL時，對O2-·清除率可達26.94%，其IC50為4.8 mg/mL，但明顯小于同濃度Vc的清除能力(P＜0.05)。

圖1 芡實多糖總還原能力Fig.1 Reducing capacity of Euryale ferox polysaccharides

圖2 芡實多糖對O2-·清除能力Fig.2 O2-·Scavenging of Euryale ferox polysaccharides

2.1.3 芡實多糖對·OH的清除能力

·OH被認(rèn)為是活性最強、毒性最大的自由基，是造成機體過氧化損傷的重要因素，輻射損傷等因素會促使其形成，螯合金屬離子或使金屬離子無反應(yīng)可清除·OH［9］。由圖3可知，芡實多糖濃度為0.2～1.0 mg/mL時，對·OH有清除作用，且隨濃度增加，清除率呈升高趨勢，濃度為1.0 mg/mL時，清除率達27.13%，其IC50為6.7 mg/mL;但同濃度條件下，清除能力明顯小于Vc(P＜0.05)。

圖3 芡實多糖對·OH清除能力Fig.3 ·OH Scavenging of Euryale ferox ploysaccharides

2.1.4 芡實多糖對DPPH·的清除能力

自由基清除劑對DPPH·的清除程度與所接受的電子數(shù)量有相關(guān)性，即清除程度與抗氧化劑的供氫能力有關(guān)［18］。由圖4可知，在0.2～1.0 mg/mL內(nèi)，芡實多糖對DPPH有較強的清除作用，且清除能力與多糖濃度呈顯著正相關(guān)，當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH·的清除率可達37.10%，其IC50為4.1 mg/mL。但小于同濃度條件下Vc的清除能力(P＜0.05)。

圖4 芡實多糖對DPPH·的清除能力Fig.4 DPPH Scavenging of Euryale ferox ploysaccharides

2.2 芡實多糖對油脂氧化的影響

2.2.1 芡實多糖對豬油的抗氧化效果

由圖5可知，芡實多糖對豬油有抗氧化作用。在65℃強化48 h內(nèi)，其抗豬油氧化能力與Vc相近;隨著時間的推移，抗氧化能力降低，而Vc仍能有效抑制豬油氧化(P＜0.05)，這與長時間加溫使芡實多糖活性喪失或油脂氧化期間積累的自由基較多有關(guān)［19］。

圖5 芡實多糖對豬油的抗氧化效果Fig.5 Antioxidant effect of Euryale ferox polysaccharides on lard

2.2.2 芡實多糖對芝麻油的抗氧化效果

由圖6可知，芡實多糖對芝麻油的抗氧化作用較強，在強化48 h內(nèi)與Vc相當(dāng);隨強化時間的延長，芡實多糖對芝麻油的抗氧化作用減弱，但Vc仍具有明顯的抗氧化作用(P＜0.05)。這可能是因為油脂氧化可產(chǎn)生大量自由基，多糖的抗氧化活性降低，POV值逐漸增大［10］。多糖和Vc對自由基的清除作用與油脂氧化所得自由基的種類及數(shù)量有關(guān)［19］，故芡實多糖和Vc對豬油和芝麻油的抗氧化性能有顯著差異(P＜0.05)。

圖6 芡實多糖對芝麻油的抗氧化效果Fig.6 Antioxidant effect of Euryale ferox polysaccharides on sesame oil

2.3 芡實多糖抑菌特性實驗結(jié)果

由表1可知，接種4種供試菌的平板上均出現(xiàn)抑菌圈，故芡實多糖對4種供試菌均有抑制作用。其中，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈明顯大于其他3種菌(P＜0.05)，芡實多糖濃度為10 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大為16.00 mm，釀酒酵母為13.63 mm，枯草桿菌為12.50 mm和大腸桿菌為11.25 mm。表明芡實多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制作用最弱。芡實多糖對大腸桿菌和枯草桿菌的最小抑菌濃度為4 mg/mL，對金黃色葡萄球菌、釀酒酵母的最小抑菌濃度為2 mg/mL。

表1 芡實多糖對各菌種的抑菌圈直徑 mmTable 1 Inhibitory zone diameters of Euryale ferox polysaccharides against different microorganisms mm

3 討論

多糖在生物體內(nèi)的功能不僅是提供能量和參與結(jié)構(gòu)組織，同時還具有多種生物功能，多糖是一種良好的天然抗氧化劑［9，16］。本實驗通過研究芡實多糖的總還原能力，對O2-·、·OH和DPPH·三種自由基的清除效果表明，芡實多糖有一定的抗氧化能力，對這3種自由基的清除率隨著芡實多糖濃度的增加而增大。多糖體外抗氧化活性與多糖濃度存在量效關(guān)系，但其抗氧化能力還有待進一步提高［10］。芡實多糖對豬油和芝麻油均有一定的抗氧化效果，在油脂氧化初期，其抗氧化效果與Vc相近。多糖對各類微生物的生長有不同程度的抑制作用或生長拮抗。

4 結(jié)論

芡實多糖具有較強的總還原能力，對O2-·、·OH和DPPH·均具有清除能力，清除能力與芡實多糖濃度呈正相關(guān)。其中，芡實多糖濃度為10 mg/mL時，對O2-·的清除率最高為26.94%，對·OH的清除率最高為27.13%，對DPPH·的清除能力最高為37.10%;芡實多糖清除O2-·、·OH和DPPH·三種自由基的IC50分別為4.8、6.7和6.1 mg/mL，但都低于Vc的清除能力。芡實多糖對豬油和芝麻油均有一定的抗氧化效果，在油脂氧化初期，其抗氧化效果與Vc相當(dāng)。芡實多糖對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母均有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，對大腸桿菌的抑制作用最弱。芡實多糖濃度為10 mg/mL時，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大為16.00 mm，釀酒酵母為13.63 mm，枯草桿菌為12.50 mm和大腸桿菌為11.25 mm。對大腸桿菌和枯草桿菌的最低抑菌濃度為4 mg/mL，對金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的最低抑菌濃度為2 mg/mL。

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