張振宇，李忠孝，袁明龍，袁明偉，陳海云，杜剛

(云南民族大學(xué)云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南昆明，650500)

乳酸是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，是重要的生物化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品等工業(yè)有廣泛的應(yīng)用［1］。目前工業(yè)上生產(chǎn)乳酸的方法主要有化學(xué)法、酶法和生物發(fā)酵法。生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸因具有產(chǎn)品的光學(xué)純度高，原料來源廣泛，生產(chǎn)成本低廉和產(chǎn)品的生物相容性好等特點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)L-乳酸的重要方法。

隨著世界聚乳酸產(chǎn)業(yè)的興起，乳酸發(fā)酵日益受到人們的重視，乳酸生產(chǎn)菌種的選育技術(shù)更是受到普遍關(guān)注，已有諸多成功的實(shí)例表明菌種水平的提高是降低乳酸生產(chǎn)成本的關(guān)鍵措施之一。目前發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸常用的微生物可分為兩類:一類為乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)，另一類為根霉菌屬(Rhizopus sp.)。國(guó)外主要以淀粉、葡萄糖等糖類或牛乳為原料，以德氏乳桿菌、干酪乳桿菌或保加利亞乳桿菌為主進(jìn)行L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn);國(guó)內(nèi)主要以淀粉為原料，以米根霉進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)的研究［2-4］。

已有從腌漬魚、肉制品中分離選育乳酸菌種用于食品加工的報(bào)道［9-11］，但直接用于乳酸發(fā)酵的則比較少見。本文從德宏傣家酸魚中分離乳酸菌，以期獲得用于乳酸發(fā)酵的優(yōu)良菌種，為乳酸發(fā)酵生產(chǎn)提供新的微生物菌株資源。

1 材料與方法

1.1 酸魚樣品

樣品采自云南省德宏傣族景頗族自治州3個(gè)地區(qū)3戶采用傳統(tǒng)工藝手工制作酸魚的農(nóng)家。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，吐溫 -80 1 mL，檸檬酸三銨2 g，CH3COONa 1 g，MnSO40.25 g，MgSO40.58 g，KH2PO42 g，蒸餾水1 000 mL，pH 自然。

產(chǎn)酸菌株篩選培養(yǎng)基［11］:葡萄糖 20 g，蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，CH3COONa 1 g，檸檬酸三胺2 g，吐溫 -80 1 mL，K2HPO42 g，KH2PO42 g，MgSO40.2 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MnSO40.25 g，NaCl 0.01 g，瓊脂16 g，CaCO316 g，溴甲酚紫 0.4 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。

乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖100 g，蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，吐溫 -80 1 mL，檸檬酸三胺 2 g，CH3COONa 1 g，K2HPO42 g，KH2PO42 g，MgSO40.2 g，F(xiàn)eSO40.01 g，MnSO40.25 g，NaCl 0.01 g，CaCO360 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 6.5。

明膠液化培養(yǎng)基［7］:MRS培養(yǎng)基分裝為每支5 mL，每支加0.6 g明膠。

產(chǎn) H2S 培養(yǎng)基［7］:蛋白胨 10 g，牛肉膏 5 g，葡萄糖 2 g，半胱氨酸 0.5 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.3。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

ScoutⅡ型電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司;LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-ZFD型無菌操作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司;快速混勻器，常州國(guó)華電器有限公司;奧立龍-868型離子酸度計(jì)，上海斯坦福生物科技發(fā)展有限公司;101A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;HP-900型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;ZHWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;雙目顯微鏡，上海華巖儀器設(shè)備有限公司;Nikon ECLIPSE E200顯微鏡，北京冠普佳科技有限公司;海爾 BCD-218A/D型冰箱，青島海爾股份有限公司;UNICO 7200型分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司;Agilent 1200型高效液相色譜，安捷倫科技有限公司;TGL-15B高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;5331型PCR儀，德國(guó)Eppendorf股份公司;Tanon 2500型凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 產(chǎn)酸菌株的分離純化

在無菌條件下，稱取酸魚樣品1 g加入99 mL無菌生理鹽水中，勻漿后作梯度稀釋。分別吸取不同梯度稀釋液各200 μL涂布于改良MRS培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，在32℃下培養(yǎng)48～72 h。隨機(jī)挑取菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線分離純化，挑取單菌落接種于產(chǎn)酸菌株篩選平板中央，用封口膜包裹平板，于32℃恒溫箱中培養(yǎng)，篩選出產(chǎn)生黃色透明水解圈的菌株。觀察菌株的菌落形態(tài)特征及顯微形態(tài)特征。

1.4.2 產(chǎn)酸菌株的生理生化特征

通過明膠液化試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣、七葉苷水解、淀粉水解等生理生化試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株進(jìn)行初步的鑒定［7］。

1.4.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

菌株用 MRS斜面轉(zhuǎn)接3次后，接種于30 mL MRS培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng) 24 h，取 5 mL培養(yǎng)物于12 000 r/min離心10 min收集菌體，液氮凍融-CTAB法提取基因組 DNA。采用通用引物27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1495r:5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'，以基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下:Taq MIX 12 μL，引物各 1 μL，模板 2 μL，加無酶水補(bǔ)足20 μL。程序如下:95℃預(yù)熱5 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后72℃末端延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后外送測(cè)序，序列用 NCBI的 Blast在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4.4 發(fā)酵分析

1.4.4.1 生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸能力試驗(yàn)

將分離得到的乳酸菌以相同的接種量接種于MRS培養(yǎng)基，32℃，120 r/min條件下培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定OD580nm值及pH值，繪制成生長(zhǎng)曲線和pH曲線。

1.4.4.2 乳酸的定性分析

采用TLC法對(duì)發(fā)酵液(發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加CaCO3)進(jìn)行分析，展開劑為甲醇∶氯仿(1∶2，v/v)，上行法一次展開，展層后用0.2%溴甲酚綠∶0.05%甲基紅∶0.5 mol/L NaOH(1∶1∶0.15，v/v)溶液噴霧顯色，藍(lán)紫色背景下呈現(xiàn)橙黃色斑點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵液呈現(xiàn)斑點(diǎn)的Rf值與乳酸標(biāo)準(zhǔn)品比較，從而對(duì)乳酸進(jìn)行定性［8］;同時(shí)用HPLC法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性。色譜條件如下:色譜柱:Agilent E-clipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm ×150 mm;流動(dòng)相，水∶甲醇(95∶5，v/v，甲酸調(diào) pH 為 3);流速，1 mL/min;柱溫，室溫;進(jìn)樣量，5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)，210 nm。

1.4.4.3 乳酸的定量分析

菌株用MRS培養(yǎng)基做種子后按5%接種量分別接至乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用250 mL錐形瓶裝液100 mL進(jìn)行發(fā)酵;35℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h后取樣，用EDTA絡(luò)合滴定法［8］對(duì)發(fā)酵液中乳酸鈣進(jìn)行定量，再按照公式進(jìn)行乳酸折算。

式中，c為物質(zhì)的量濃度;M乳酸表示乳酸的摩爾質(zhì)量，取90.08 g/mol;M乳酸鈣表示乳酸鈣的摩爾質(zhì)量，取308.3 g/mol。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸菌株的分離純化

3份酸魚樣品經(jīng)MRS平板分離純化得到10株純化菌株。在產(chǎn)酸菌株篩選平板上，菌株sy1、sy3、sy4在平板中央產(chǎn)生明顯的變色溶鈣圈(如圖1所示)，表明3株菌為產(chǎn)酸菌株。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，sy1為鏈狀長(zhǎng)桿菌、較細(xì)長(zhǎng);sy3、sy4均為短桿菌、較小;以上3株菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌;結(jié)果見表1。對(duì)菌株sy1、sy3、sy4進(jìn)行了部分生理生化實(shí)驗(yàn)，初步判斷3株菌均為乳酸菌，結(jié)果見表2。

圖1 初篩平板Fig.1 Results of preliminary screening

表1 菌株形態(tài)學(xué)觀察Table 1 Results of the morphological identification

表2 菌株的生理生化特征Table 2 Results of physiological and biochemical identification

2.2 16S rDNA序列分析

3株菌16S rDNA PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，顯示在1 500bp左右均有條帶，說明各菌株目標(biāo)片段均被成功擴(kuò)增，將PCR原液外送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Blast在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，從列出結(jié)果中挑選同源性最高且對(duì)比菌株為該種模式株的作為鑒定結(jié)果，3株乳酸菌16S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果見表3。

圖2 16S rDNA PCR產(chǎn)物檢測(cè)Fig.2 Results of 16s rDNA PCR product detection

提取相似度在98%以上的相關(guān)模式株的序列，利用MEGA5.2軟件將測(cè)得序列與GenBank中的登錄菌株16S rDNA序列進(jìn)行分析，以鄰域連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得菌株sy1、sy3、sy4的分類地位及系統(tǒng)發(fā)育地位。由表3和圖3可知，菌株sy1、sy3、sy4與登錄菌株Lactobacillus plantarum KLDS 1.0728同源性均達(dá)到99%，并與其聚在一起，所以將3株菌均鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)。菌株提交Gen-Bank，獲得登錄號(hào)，其中菌株sy1登錄號(hào)為KJ801850，菌株 sy3登錄號(hào)為 KM023152，菌株 sy4登錄號(hào)為KJ801851。

表3 分離乳酸菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果Table 3 The identification result of LAB based on 16S rDNA sequencing

2.3 發(fā)酵分析

從圖4的生長(zhǎng)曲線可看出，菌株sy3生長(zhǎng)適應(yīng)期較短，接種4～12 h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，其最終菌體量是最大的;菌株sy1生長(zhǎng)適應(yīng)期較長(zhǎng)，前10 h為適應(yīng)期，10～18 h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期;菌株sy4整個(gè)生長(zhǎng)曲線較平緩，6～14 h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。從圖5的pH變化情況來看，菌株sy3產(chǎn)酸最快，接種后前8 h急劇產(chǎn)酸，8 h后pH下降趨于平緩;菌株sy1前10 h產(chǎn)酸緩慢，12～18 h產(chǎn)酸迅速，18 h后趨于平緩;菌株sy4整個(gè)pH變化曲線最為平緩?？煽闯觯瑘D4和圖5的變化趨勢(shì)相符，反映出3株菌生長(zhǎng)情況和產(chǎn)酸量之間具有正相關(guān)性，產(chǎn)酸量隨菌株生長(zhǎng)情況一致呈現(xiàn)出慢-快-慢的趨勢(shì)。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of three lactic acid bacteria strains

圖4 乳酸菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of three lactic acid bacteria strains

圖5 乳酸發(fā)酵pH曲線Fig.5 pH curves of three lactic acid bacteria strains

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物分析

采用TLC法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析，菌株sy1、sy3、sy4發(fā)酵液經(jīng)點(diǎn)樣、展層、顯色，顯示藍(lán)紫色背景下，各樣品在乳酸標(biāo)準(zhǔn)品Rf值處均有清晰可見的黃色斑點(diǎn);同時(shí) HPLC法分析顯示各發(fā)酵液在保留時(shí)間2.15 min附近均有峰出現(xiàn)，這與相同色譜條件下乳酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間2.148 min相符，如圖6和圖7所示。以上2種色譜分析方法結(jié)果一致，從而對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性。

圖6 HPLC檢測(cè)乳酸標(biāo)準(zhǔn)品Fig.6 HPLC detection of standard lactic acid

圖7 HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中乳酸Fig.7 HPLC detection of lactic acid in fermentation broth

搖瓶發(fā)酵72 h，經(jīng)EDTA定鈣法測(cè)定，sy1發(fā)酵液中乳酸鈣質(zhì)量濃度為113.34 g/L，sy3發(fā)酵液中乳酸鈣質(zhì)量濃度為130.13 g/L，sy4發(fā)酵液中乳酸鈣質(zhì)量濃度為118.09 g/L。經(jīng)折算，菌株sy1乳酸產(chǎn)量為66 g/L，菌株sy3乳酸產(chǎn)量為76 g/L，菌株sy4乳酸產(chǎn)量為69 g/L。以上結(jié)果同圖5中菌株的pH變化情況一致。

3 結(jié)論

本文從傣家傳統(tǒng)酸魚制品中分離篩選出sy1、sy3、sy4 3株乳酸菌，經(jīng)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)有關(guān)菌種的鑒定方法結(jié)合16S rDNA序列分析，3株菌均鑒定為植物乳桿菌，從鑒定結(jié)果初步推斷植物乳桿菌是傣家酸魚發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)乳酸菌群。

乳酸發(fā)酵結(jié)果表明，3株菌在24 h培養(yǎng)周期內(nèi)即能迅速產(chǎn)生乳酸，能在pH低于3.5以下生長(zhǎng)。在初始糖濃度為100 g/L的搖瓶發(fā)酵中，經(jīng)72 h發(fā)酵，檢測(cè)到菌株 sy1、sy3、sy4 乳酸產(chǎn)量分別為 66、76、69 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率較高，表明所分離菌株具有較好的乳酸發(fā)酵性能。雖然與現(xiàn)有生產(chǎn)菌株相比乳酸發(fā)酵效率略低，但可作為出發(fā)菌株做進(jìn)一步的乳酸發(fā)酵研究，本實(shí)驗(yàn)為乳酸生產(chǎn)提供了新的微生物菌株資源。

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