申超，吳殿輝，李曉敏，謝廣發(fā)，陸健，5，陳堅

1(江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

4(中國紹興黃酒集團有限公司國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興，312000)

5(宿遷市江南大學產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷，223800)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)是發(fā)酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪等)和酒精飲料(如葡萄酒、中國黃酒和日本清酒等)的伴隨副產(chǎn)物，具有致癌作用［1］。自2002年以來，EC已經(jīng)成為世界衛(wèi)生組織重點監(jiān)控物質(zhì)之一，2007年國際癌癥研究機構(gòu)確認EC為人類潛在致癌物質(zhì)(2A類)［2］。發(fā)酵酒中絕大多數(shù)的EC是由尿素與乙醇反應(yīng)而生成，發(fā)酵過程中尿素含量的多少將直接影響發(fā)酵酒中EC含量的高低［3］，因而降低EC的前體物質(zhì)——尿素的含量，是減少發(fā)酵酒中EC的主要途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵酒中的尿素主要是由酵母菌在代謝過程中分解精氨酸而產(chǎn)生［4］。當微生物胞內(nèi)缺少可以優(yōu)先利用的氮源時，胞外的尿素可由細胞膜上的尿素轉(zhuǎn)運蛋白(DUR3編碼)轉(zhuǎn)入胞內(nèi)作為氮源，從而被酵母代謝消耗掉。

尿素轉(zhuǎn)運蛋白由DUR3編碼，其主要功能是促進胞外尿素、多胺、硼等向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，而DUR3 mRNA在大量多胺存在時，常處于被抑制狀態(tài)［5－6］。有研究表明，在酵母細胞內(nèi)過表達DUR3時，胞內(nèi)尿素、多胺濃度升高，而硼濃度并沒有明顯的變化［7］。

在降低發(fā)酵酒中尿素含量的探索中，更多的學者集中在對精氨酸酶(由CAR1編碼)、脲基酰胺酶(由DUR1，2 編碼)的研究［8］，通過失活精氨酸酶基因(敲除CAR1基因)、過表達脲基酰胺酶基因(過表達DUR1，2基因)來實現(xiàn)降低發(fā)酵酒中尿素含量。

而對釀酒酵母中尿素轉(zhuǎn)運蛋白(由DUR3編碼)的研究，目前僅見Dahabieh對清酒酵母與葡萄酒酵母進行改造，實現(xiàn)了DUR3基因的過表達，過表達DUR3基因工程菌在葡萄酒與清酒釀造過程中，可分別降低EC含量的82.96%與11.49%，并且在發(fā)酵力、代謝產(chǎn)物等方面與親本菌株具有實質(zhì)等同性［6］。相同的代謝改造所引起的工程菌效果的差異可能與不同的酒種釀造工藝及不同酵母體系的代謝過程有關(guān)。

本研究采用自克隆技術(shù)，以酵母遺傳工程中重要的遺傳標記 URA3 為篩選標記［9－10］，以釀酒酵 3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的強啟動子(PGK1p)和終止子(PGK1)為調(diào)控元件，構(gòu)建過表達組件“URA3－PGK1p－DUR3－PGK1t－URA3”，轉(zhuǎn)化工業(yè)黃酒酵母單倍體。通過實驗室規(guī)模發(fā)酵實驗，驗證了該工程菌具有可降低發(fā)酵液中尿素含量的優(yōu)良性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

工業(yè)黃酒酵母N85單倍體Na(MATa)、大腸桿菌JM109、pMGKR質(zhì)粒，本實驗室保存。其中:單倍體Na從工業(yè)二倍體菌株N85中通過敲除HO基因分離獲得;pMGKR質(zhì)粒帶有Ampr抗性基因，且攜有釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)強啟動子。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%)用于酵母菌的培養(yǎng)和保存;LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%)用于大腸桿菌的培養(yǎng)和保存;5-氟乳清酸培養(yǎng)基(5-FOA)［葡萄糖2%，(NH4)2SO40.5%，0.17%YNB，脯氨酸0.1%，尿嘧啶0.005%，5-氟乳清酸0.125%，瓊脂2%］用于篩選DUR3轉(zhuǎn)化子;基本培養(yǎng)基(MM)［葡萄糖2%，(NH4)2SO40.5%，0.17%YNB，瓊脂2%］用于驗證DUR3轉(zhuǎn)化子;添加50 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基用于篩選含pMGKR質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。

1.1.3 酶和主要試劑

Prime STAR DNA聚合酶，ExTaq DNA聚合酶，rTaq DNA 聚合酶，內(nèi)切酶(Sal I、BamH I)，T4DNA連接酶，pMD18-T載體試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒，氨芐青霉素(Amp)，YNB，5-氟乳清酸，脯氨酸，尿嘧啶，購自生工生物工程(上海)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。DNA片段由上海生工測序。

1.1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI中公布的釀酒酵母 URA3、DUR3與PGK1基因的核苷酸序列，設(shè)計了表1中的擴增引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本實驗中所需的引物Table 1 Primers used in the present study

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pMGKR-DUR3的構(gòu)建

提取單倍體Na基因組DNA［11］，并以其為模板，D3－1/D3－2為引物，ExTaq DNA聚合酶進行PCR擴增。經(jīng)瓊脂糖電泳驗證，并割膠按照DNA膠回收試劑盒說明書的要求進行純化回收。參照《分子克隆實驗指南》［12］，以 DUR3為目的基因、pMD18－T為載體進行T－A克隆，獲得質(zhì)粒pMD18－DUR3，并送樣測序驗證。

質(zhì)粒pMD18－DUR3與pMGKR分別經(jīng)Bam H I和Sal I雙酶切，回收DUR3片段(2 216bp)和線性化的質(zhì)粒pMGKR(6 644bp)，在T4DNA連接酶作用下，連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，挑取陽性克隆子提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR、酶切和送樣測序驗證。構(gòu)建過程見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pMGKR-DUR3的構(gòu)建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pMGKR-DUR3

1.2.2 釀酒酵母過表達組件的構(gòu)建

分別以 U3－1p/U3－1t、U3－2p/U3－2t為引物，酵母基因組為模板;PDT－1/PDT－2為引物，pMGKR－DUR3質(zhì)粒為模板，用Prime STAR DNA聚合酶進行擴增，純化回收PCR產(chǎn)物獲得URA3上游同源臂(URA3－L)、URA3下游同源臂(URA3-R)及兩端帶有重疊序列的“PGK1p-DUR3-PGK1t”片段。

基于融合PCR的原理［13］，采用一種高效構(gòu)建基因組件的方法［14］，以 URA3-L、URA3-R、“PGK1p-DUR3-PGK1t”為模板，用Prime STAR DNA聚合酶進行融合PCR反應(yīng)，再以融合PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，U3-1p/U3-2t為引物，ExTaq DNA聚合酶進行融合片段的全長擴增，獲得過表達組件“URA3-PGK1p-DUR3-PGK1t-URA3”，見圖2。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化單倍體Na與轉(zhuǎn)化子的鑒定

釀酒酵母轉(zhuǎn)化采用高效電轉(zhuǎn)化法［15－17］，轉(zhuǎn)化后的細胞涂布于現(xiàn)配的5-FOA平板，倒置于30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出，以U3-1p/Pp-2為引物進行菌落PCR初次驗證，并對鑒定正確的轉(zhuǎn)化子Na-uD提取基因組，以U3-1p/U3-2t為引物進行再次驗證?；厥照_的PCR擴增條帶，測序驗證。轉(zhuǎn)化原理見圖2。

圖2 工程菌酵母構(gòu)建示意圖Fig．2 Summary of the construction of an engineering yeast strain

1.2.4 實驗室規(guī)模黃酒釀造實驗

分別以工程菌株和出發(fā)菌株進行黃酒釀造實驗。黃酒釀造工藝流程:浸米→蒸飯→冷卻→拌曲→接種→前酵→后酵→過濾澄清→煎酒→貯存。

1.2.5 發(fā)酵液指標測定

常規(guī)理化指標(總糖、酒精度和氨基態(tài)氮)的測定:按《中華人民共和國國家標準—黃酒》(GB/T 13662 －2008)中規(guī)定的方法［18］，分別測定。

尿素含量的測定:采用高效液相色譜法-熒光檢測器法［19］。

EC含量的測定:采用固相萃取-同位素稀釋法［20］，測定煎酒后發(fā)酵液中EC的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 重組質(zhì)粒pMGKR-DUR3的構(gòu)建與鑒定

按照1.2.1中的方法，獲得重組質(zhì)粒pMGKRDUR3，以PDT-1/PDT-2為引物，進行PCR驗證。如圖3所示，以重組質(zhì)粒為模板可擴增出3.3kbp的條帶，與預(yù)期片段3 360bp大小相符，證明重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功;經(jīng)酶切驗證表明 DUR3基因的方向與PGK1強啟動子、終止子的方向一致。

2.1.2 過表達組件的構(gòu)建與鑒定

按照1.2.2中所述的融合PCR方法，獲得過表達組件“URA3-PGK1p-DUR3-PGK1t-URA3”。圖4的PCR驗證結(jié)果表明:過表達組件大小為4 304bp，與預(yù)計片段大小相符，已完全融合成功。

圖3 重組質(zhì)粒pMGKR-DUR3的PCR驗證Fig．3 The verification of recombinant plasmid pMGKR-DUR3 by PCR

圖4 過表達組件的融合及鑒定Fig．4 The fusion verification of DUR3 expression cassette

2.1.3 過表達組件轉(zhuǎn)化單倍體Na的鑒定

因尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型能進行陽性選擇和陰性選擇:尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株無法在MM上生長，而能在5-FOA培養(yǎng)基上正常生長;而對于野生型菌株，具備對5-FOA的抗性，則不能在5-FOA培養(yǎng)基上生長，但能在 MM 上正常生長［9，21－22］。根據(jù)這一特性，挑取轉(zhuǎn)化子劃線于MM平板上，單倍體Na作對照，如圖5所示。初步鑒定不能生長的轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)化正確的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型工程菌。

圖5 轉(zhuǎn)化子劃線于MM上鑒定Fig．5 The verification of transformants on MM plants

提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，以U3-1p/U3-2t為引物，進行PCR擴增驗證。如圖6所示，轉(zhuǎn)化子有一條4 304 bp大小的“URA3-PGK1p-DUR3-PGK1t-URA3”擴增片段，與預(yù)期結(jié)果相符;而陰性對照則只能擴增出1 150bp大小的URA3全基因片段，空白對照無任何條帶，證明過表達組件已整合進酵母工程菌的基因組。

圖6 轉(zhuǎn)化子Na-uD的PCR擴增鑒定Fig．6 The verification of Na-uD transformant by PCR

2.2 發(fā)酵性能驗證

按照1.2.5中的方法，分別對發(fā)酵液中的常規(guī)理化指標與尿素進行測定。如表2所述，工程菌Na-uD的尿素含量(13.64 mg/L)較親本菌株Na(30.30 mg/L)降低了55.0%，EC含量(44.80μg/L)較親本菌株(50.30μg/L)降低了10.9%，并且各項理化指標與出發(fā)菌株的基本保持一致，說明該工程菌降低了發(fā)酵酒中尿素的含量，且不會對黃酒的品質(zhì)造成影響，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。實驗表明，發(fā)酵液中EC含量的降低幅度較小，可能是由釀酒酵母的生長代謝及尿素分泌具有菌株特異性所引起的［23］。

表2 不同菌株黃酒發(fā)酵實驗各指標的測定Table 2 The indexes of Chinese rice wine brewed with different strains

3 討論

本研究從工業(yè)黃酒酵母單倍體出發(fā)，基于自克隆技術(shù)原理，實現(xiàn)了對酵母單倍體DUR3基因的過表達，得到1株過表達DUR3基因的工程菌Na-uD，該菌株無外源基因的引入，具有很好的“吸收尿素”的能力。在不影響黃酒其他指標的前提下，可降低發(fā)酵液中尿素含量的55.0%，EC含量的10.9%。

研究結(jié)果表明，過表達DUR3基因的酵母工程菌在降低發(fā)酵液中尿素含量方面起到了一定的作用。對DUR3基因的成功改造，為降低發(fā)酵酒中尿素的含量開辟了新的途徑。

釀酒酵母尿素代謝還受到CAR1、DUR1，2、DUR4等其他相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，敲除CAR1基因能夠阻斷尿素的生成，過表達DUR1，2基因能夠快速降解殘留的尿素，敲除DUR4基因能夠阻斷胞內(nèi)尿素向胞外的運輸，而過表達DUR3基因則能夠快速將胞外尿素轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，以供細胞利用。若能對上述相關(guān)基因同時進行修飾改造，以達到多代謝途徑協(xié)同作用，可能會對降低發(fā)酵液中尿素含量有更為顯著的效果。

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