彭 瀛， 周廣亮， 沈明花

（延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅作為血液與血管平滑肌之間的機(jī)械屏障，而且又是機(jī)體最大的內(nèi)分泌器官[1]，在調(diào)節(jié)血管緊張度、抗血小板聚集以及抗凝促纖溶等過程中起著重要的作用，其抗栓作用越來越受到重視。血栓是血液中纖維蛋白多聚體與細(xì)胞組成的復(fù)合物，其形成與諸多因素有關(guān)，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與血栓形成密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度凋亡是血栓形成的重要原因。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium），又名大榆蘑。屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其發(fā)酵液具有抗氧化[2]、溶栓[3]作用。作者主要探討榆干離褶傘發(fā)酵液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，為榆干離褶傘的溶栓機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品的制備 榆干離褶傘菌種：由韓國(guó)益山大學(xué)特種作物加工實(shí)驗(yàn)室提供。在25℃、150 r/min液體深層二級(jí)培養(yǎng)15 d。將發(fā)酵液用紗布過濾，收集濾液以3 000 r/min離心15 min，將上清液進(jìn)行冷凍干燥，得樣品。

1.1.2 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）： 購(gòu)自北京宏寶達(dá)生物科技有限公司

1.1.3 試劑 MTT和DMSO：Sigma公司；Annexin-V-Fluos試劑盒：美國(guó)Roche公司；DMEM培養(yǎng)基：Gibco公司；胎牛血清和胰酶：華美生物工程公司；兔抗 bcl-2、bax、Caspase-3 和 Caspase-9 抗體：美國(guó)Santa Cruz公司；LDH試劑盒：南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

倒置顯微鏡：日本日立公司；酶標(biāo)儀：日本島津公司；流式細(xì)胞儀：Beckman公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%時(shí)更換為無血清培養(yǎng)基，做以下實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 MTT法檢測(cè)LU發(fā)酵液的細(xì)胞毒性作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁后，分4組，分別為空白對(duì)照組、低、中、高劑量LU發(fā)酵液用藥組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。用藥組分別加入終質(zhì)量濃度為20、40、80 mg/L的LU發(fā)酵液，而空白對(duì)照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)基。各組分別培養(yǎng)24、48 h后每孔加入預(yù)先配制的MTT液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。吸去每孔培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩5 min后，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔光吸收值（A），按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：

1.3.3 LU發(fā)酵液對(duì)H2O2所致?lián)p傷細(xì)胞存活率的影響 取前述傳代細(xì)胞接種到96孔板中，分為正常對(duì)照組、模型組和發(fā)酵液低（20 mg/L）、中（40 mg/L）、高（80 mg/L）劑量用藥組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。首先用藥組以低、中、高劑量發(fā)酵液預(yù)處理細(xì)胞24 h，正常對(duì)照組和模型組以無血清培養(yǎng)基代替。24 h后，除正常對(duì)照組外其余各組均加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后按方法1.3.2進(jìn)行MTT檢測(cè)。

1.3.4 細(xì)胞上清液LDH的測(cè)定 收集各組上清液以測(cè)LDH活性。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞接種于6孔板，分組及處理同1.3.3。培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化并收集細(xì)胞，用PBS沖洗兩次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)。按美國(guó)Roche公司提供的試劑盒說明書操作，進(jìn)行流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)。

1.3.6 Western Blot法檢測(cè) Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá) 分組及處理方法同1.3.3。分別收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，參照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影及定影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用xˉ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LU發(fā)酵液對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

與正常組相比，中、高劑量組處理HUVEC 24、48 h后細(xì)胞活力高于正常組，這就說明用藥劑量范圍內(nèi)LU發(fā)酵液對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞無毒性作用，反而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，見表1。

2.2 LU發(fā)酵液對(duì)損傷細(xì)胞存活率及LDH的影響

如表2所示，模型組細(xì)胞存活率顯著低于正常組，LDH活性顯著高于正常組，說明H2O2作用以后損傷或死亡的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)增多。用LU發(fā)酵液預(yù)處理以后，中、高劑量組細(xì)胞活力顯著高于模型組，且高劑量組的LDH活性顯著低于模型組，這就提示LU發(fā)酵液具有保護(hù)HUVEC的作用。

表1 LU發(fā)酵液對(duì)正常HUVEC存活率的影響Table 1 Effect of LU fermentation broth on survival rates of HUVECs

表2 LU發(fā)酵液對(duì)損傷細(xì)胞存活率及LDH的影響Table 2 Effect of LU fermentation broth on surviaval rates and LDH of cells with injury

2.3 LU發(fā)酵液對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

圖1中A～E均為由四個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖，每個(gè)圖中左下象限代表正常細(xì)胞群（An-PI-），右下象限代表早期凋亡細(xì)胞群（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（An+PI+），左上象限代表為非特異死亡細(xì)胞（An-PI+）。與正常組相比，模型組凋亡率（47.24%）顯著增多，說明H2O2誘導(dǎo)的HUVEC凋亡模型制備成功。各劑量用藥組凋亡數(shù)明顯減少（p＜0.05），但無量效關(guān)系。

2.4 Bax、Bcl-2、Caspase-9 和 Caspase-3 蛋白質(zhì)的表達(dá)結(jié)果

如圖2所示，與正常組比較，模型組Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表達(dá)顯著增加，而Bcl-2基因表達(dá)變化不明顯。與模型組比較，各劑量用藥組Bax、Caspase-9和Caspase-3基因表達(dá)減少，而Bcl-2基因表達(dá)增多。

3 結(jié)語

圖1 LU發(fā)酵液對(duì)HUVEC細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Effect of LU fermentation broth on apoptosis of HUVEC

MTT法常用于生物活性因子的活性檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中所用的劑量范圍內(nèi)榆干離褶傘發(fā)酵液對(duì)HUVEC無細(xì)胞毒性，促進(jìn)HUVEC的增殖。過氧化氫誘導(dǎo)HUVEC損傷后細(xì)胞存活率顯著下降，而用榆干離褶傘發(fā)酵液預(yù)處理時(shí)，其存活率明顯增高，這就提示榆干離褶傘發(fā)酵液對(duì)HUVEC的氧化損傷有保護(hù)作用。我們?cè)鴪?bào)道過榆干離褶傘發(fā)酵液的抗氧化作用[2]，由此可認(rèn)為榆干離褶傘發(fā)酵液對(duì)HUVEC的保護(hù)作用與其抗氧化作用密切相關(guān)。當(dāng)過氧化氫作用于HUVEC后，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，由此細(xì)胞的完整性遭到破壞，引起細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞上清液LDH活性增加。以榆干離褶傘發(fā)酵液處理細(xì)胞后，因它對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，所以用藥組細(xì)胞上清液的LDH活性明顯降低。

圖2 LU發(fā)酵液對(duì)Bax、Bcl-2、Caspase-9和 Caspase-3蛋白質(zhì)的表達(dá)的影響Fig.2 Effect of LU fermentation broth on the protein expression of bcl-2,bax,caspase-3 and caspase-9

為了進(jìn)一步探討榆干離褶傘發(fā)酵液對(duì)HUVEC的保護(hù)作用機(jī)制，用過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型，觀察了榆干離褶傘對(duì)凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組凋亡率47.24%，而用藥組凋亡率明顯下降，分別為18.1%、19.62%、13.47%，這就說明榆干離褶傘具有抑制凋亡的作用。在細(xì)胞凋亡調(diào)控的眾多基因中，Bcl-2和Bax是關(guān)鍵基因，其中BcI-2是凋亡抑制的基因，而Bax是凋亡促進(jìn)基因。而當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)時(shí)，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，啟動(dòng)凋亡；而當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)，則Bax/Bax二聚體大量解離，生成更為穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異源二聚體，對(duì)抗其誘導(dǎo)凋亡的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，模型組的Bax表達(dá)比正常組明顯增多；在用藥組中其表達(dá)量隨著劑量的增加逐漸減少，而Bcl-2的表達(dá)逐漸增多，這就提示榆干離褶傘發(fā)酵液可拮抗由過氧化氫引起的細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)，H2O2主要通過激活經(jīng)典的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。在線粒體通路凋亡途徑中，當(dāng)細(xì)胞受到過氧化氫等氧化應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體膜通透性增加，釋放出細(xì)胞色素 C，并與細(xì)胞凋亡激活因子 1（Apoptotic protease activating factor l，Apaf-）結(jié)合， 并活化Caspase-9的前體，進(jìn)而激活Caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Bax是在線粒體外膜通過形成離子通道方式促進(jìn)細(xì)胞色素C等蛋白質(zhì)分子釋放[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Caspase-9和Caspase-3明顯增加，表明過氧化氫通過影響B(tài)ax基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體釋放大量的包括細(xì)胞色素C在內(nèi)的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)Caspase的激活。用榆干離褶傘發(fā)酵液預(yù)處理后，Bax/Bcl-2比值下降，Caspase-9和Caspase-3基因表達(dá)減少，這就提示榆干離褶傘發(fā)酵液可能通過抑制或阻斷線粒體凋亡通路，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用有可能作為它的溶栓作用機(jī)制之一。

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