周文淵， 張宏梅， 姜 燕， 黃慧嫦， 陳勝華，廖丁妹， 郭 凱， 張文艷， 楊安林

（廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

生物被膜是指由細(xì)菌嵌入自身分泌的多糖、蛋白質(zhì)和DNA等多聚物組成的一種結(jié)構(gòu)化聚合體，以增加自己對(duì)于外界環(huán)境的適應(yīng)性[1-2]。據(jù)調(diào)查，生物被膜中微生物通過形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其耐受殺菌劑以及機(jī)械損傷的能力可提高數(shù)百至上千倍[3-4]。隨著對(duì)生物被膜研究的深入，發(fā)現(xiàn)生物被膜通常不是只由一種微生物構(gòu)成，而是通過多種微生物形成的混合菌生物被膜，且其具有更強(qiáng)的脅迫環(huán)境耐受能力[5-6]。近來研究表明，群體感應(yīng)與生物被膜的形成密切相關(guān)，在群體感應(yīng)系統(tǒng)中，各類信號(hào)分子在調(diào)控生物被膜的形成中起到非常重要的作用。其中信號(hào)分子Autoinducers-II（AI-2）是細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)的一種，是革蘭氏陽性菌和陰性菌可共同識(shí)別并作出反應(yīng)的一類通用信號(hào)分子，在調(diào)控混合菌生物被膜的形成中具有重要作用[7-8]。

在食品工業(yè)中，為避免生物被膜產(chǎn)生抗性而過量使用消毒與防腐劑導(dǎo)致的食品安全問題不容忽視。致病微生物的殘留或過量使用消毒劑造成藥物的殘留直接帶來極大的食品安全隱患。因此，尋求一種天然、安全有效的天然產(chǎn)物抑制生物被膜刻不容緩。食品添加劑是一種少量添加于食品，以改善食品的外觀、風(fēng)味和組織結(jié)構(gòu)或貯存性質(zhì)的非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。很多學(xué)者證明多種食品添加劑具有抑菌效果[9-10]。根據(jù)前人研究，我們篩選出常見抑菌效果最好的茶多酚、檸檬醛和肉桂醛作為研究對(duì)象。茶多酚、檸檬醛和肉桂醛都是來自于天然植物的最常見的食品添加劑，已有研究表明，它們對(duì)多種致病菌具有抑制作用[9-10]，但關(guān)于其抑制細(xì)菌混合生物被膜的研究卻很少。因此，作者通過微孔板法研究茶多酚、檸檬醛和肉桂醛對(duì)三種常見的食源性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，腸炎沙門氏菌，大腸桿菌）的最小抑菌濃度，及其在亞抑菌濃度時(shí)對(duì)3種細(xì)菌及其混合菌生物被膜形成能力及群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2活力的影響，為其在食品工業(yè)中抑制生物被膜形成的廣泛應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門氏菌ATCC14028和大腸桿菌ATCC8739：作者所在實(shí)驗(yàn)室于-80℃保存；哈氏弧菌V.BB170：購(gòu)自美國(guó)ATCC菌株保藏中心；茶多酚（純度≥98%）：廣州齊云生物技術(shù)有限公司；檸檬醛和肉桂醛 （純度≥99%）：上海晶純?cè)噭┯邢薰?；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB培養(yǎng)基）：青島海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；96孔板：德國(guó)Coming Costar公司；Model 680酶標(biāo)儀：BioRad公司；多功能酶標(biāo)儀Infinite200：瑞士Tecan公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]并加以改進(jìn)，通過二倍稀釋法將購(gòu)買的茶多酚、肉桂醛、檸檬醛原液分別稀釋，茶多酚的質(zhì)量濃度梯度為 0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，檸檬醛和肉桂醛濃度梯度為 0.125、0.25、0.5、1、2、4 μL/mL。 將過夜培養(yǎng)的3種細(xì)菌金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門氏菌ATCC14028和大腸桿菌ATCC8739稀釋一定倍數(shù)后，通過標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芘涑?.5麥（1.5×108cfu/mL），然后添加適量菌懸液至配有不同濃度茶多酚、檸檬醛和肉桂醛的試管中，混合均勻后，37℃搖床下培養(yǎng)18 h后取出觀察，以不接菌的不同天然產(chǎn)物培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以肉眼看不到試管內(nèi)渾濁的最高濃度為最小抑菌濃度，重復(fù)3次。

1.3.2 生物被膜的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn) [12]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將過夜培養(yǎng)的3種細(xì)菌金黃色葡萄球菌ATCC25923、腸炎沙門氏菌ATCC14028和大腸桿菌ATCC8739配成0.5麥后，分別取1 μL以及三種細(xì)菌各取1 μL接種于事先配好含有不同濃度茶多酚、檸檬醛和肉桂醛（0、1/2MIC、1/4MIC）的 100 μL TSB培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)96孔板中，將未接菌的不同濃度天然產(chǎn)物培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。37℃過夜培養(yǎng)24 h后，倒掉培養(yǎng)基，用蒸餾水水洗3次去除浮游菌，微孔板在室溫下干燥2 h，加入10 g/L結(jié)晶紫100 μL/孔，放置20 min后，蒸餾水洗6～7次去除孔壁染液直至水洗液為無色，孔板在室溫下干燥30 min，加入95%乙醇100 μL/孔，微量振蕩器上振蕩30 min后，于630 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度A值。實(shí)驗(yàn)平行3次。

1.3.3 細(xì)菌AI-2活力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7，13]，將哈氏弧菌V.BB170活化后，置于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，200 r/min下培養(yǎng)16 h，然后用新鮮AB培養(yǎng)基將其稀釋5 000倍后備用。同時(shí)，將3種測(cè)試菌株及其混合菌株接種于含有1/4MIC濃度的不同天然產(chǎn)物TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h后，接著在13 000 r/min下離心5 min后取上清液，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取10 μL與稀釋過的VBB170培養(yǎng)物100 μL混合后加入96孔板中。同時(shí)以各種細(xì)菌在不添加添加劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的無細(xì)胞上清液作為陽性對(duì)照。全部置于30℃下恒溫振蕩培養(yǎng)。用多功能酶標(biāo)儀Infinite200每隔1 h測(cè)一次發(fā)光值，直至5 h。以陽性對(duì)照的發(fā)光值為基數(shù)，計(jì)算3種菌的AI-2活力引起V.BB170發(fā)光相對(duì)值，該實(shí)驗(yàn)平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚、檸檬醛、肉桂醛的最小抑菌濃度

通過二倍稀釋法，測(cè)定3種添加劑對(duì)3種細(xì)菌的MIC。從圖1可以看出，茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好（0.5 mg/mL），而對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC是2 mg/mL。檸檬醛對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果最好（0.5 μL/mL），而對(duì)沙門氏菌的MIC是2 μL/mL。肉桂醛對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌的抑制效果最好（1 μL/mL），而對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC是2 μL/mL。結(jié)果表明，3種添加劑對(duì)3種細(xì)菌的抑制效果均不相同。

圖1 茶多酚、檸檬醛、肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的最小抑菌濃度Fig.1 MICs of tea polyphenols citral and cinnamaldehyde against S.aureus，E.coli and Salmonella enteritidis

2.2 亞抑菌濃度下各種添加劑對(duì)3種細(xì)菌及其混合菌生物膜形成的影響

通過微孔板法測(cè)定3種添加劑對(duì)3種細(xì)菌及其混合菌生物膜形成的影響。以不加入添加劑微生物成膜的A630為基數(shù)，計(jì)算不同種類及濃度的添加劑影響生物膜形成相對(duì)值。由圖2～5可知，隨著加入3種添加劑的濃度不斷增加，3種細(xì)菌以及混合菌的生物被膜形成能力不斷下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)于金黃色葡萄球菌和混合菌的生物被膜形成抑制效果最好，與不加入茶多酚的對(duì)照相比，金黃色葡萄球菌的生物被膜變?yōu)樵瓉淼?0%（1/4MIC）和38%（1/2MIC），混合菌的生物被膜形成變?yōu)樵瓉淼?2%（1/4MIC）和12%（1/2MIC）。肉桂醛對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果最好，加入肉桂醛之后，大腸桿菌的生物被膜變?yōu)樵瓉淼?9%（1/4MIC）和12%（1/2MIC），沙門氏菌的生物被膜變?yōu)樵瓉淼?41%（1/4MIC）和 10%（1/2MIC）。

圖2 亞抑菌濃度的添加劑對(duì)金黃色葡萄球菌成膜率的影響Fig.2 Effects of different concentration of three additive products on biofilm formation of S.aureus

圖3 亞抑菌濃度的添加劑對(duì)腸炎沙門氏菌成膜率的影響Fig.3 Effects of different concentration of three additive products on biofilm formation of Salmonella

圖4 亞抑菌濃度的添加劑對(duì)大腸桿菌成膜率的影響Fig.4 Effects of different concentration of three additive products on biofilm formation of E.coli

圖5 亞抑菌濃度的添加劑對(duì)混合菌成膜率的影響Fig.5 Effects of different concentration of three additive products on biofilm formation of mixed isolates

2.3 亞抑菌濃度（1/4MIC）下各種添加劑對(duì)3種菌及其混合菌AI-2的影響

如圖6所示，3種添加劑中只有檸檬醛對(duì)于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌AI-2具有抑制作用，抑制率為33%。而對(duì)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌和沙門氏菌，三種天然添加劑對(duì)其AI-2均具有不同程度的抑制作用。但其中檸檬醛對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果最明顯，加入檸檬醛之后，大腸桿菌和沙門氏菌的AI-2活力分別變?yōu)樵瓉淼?9%和37%。而當(dāng)三種細(xì)菌混合以后，三種天然添加劑對(duì)AI-2的抑制效果都很好，其中效果最好的檸檬醛可以抑制混合菌90%的AI-2活力。由此可見，檸檬醛對(duì)于金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）、大腸桿菌和沙門氏菌（革蘭氏陰性菌）及其混合菌的AI-2都具有抑制效果而且效果最好。

圖6 亞抑菌濃度下茶多酚，檸檬醛和肉桂醛抑制細(xì)菌AI-2活力Fig.6 Effects of three additive products at sub-MIC on AI-2 activity of S.aureus，Salmonella，E.coli and the mixed isolates

3 結(jié)語

茶多酚提取自茶葉中，是茶葉中黃烷醇類、花色苷類和黃酮類物質(zhì)的總稱，具有強(qiáng)烈的抗氧化作用。很多研究表明，茶多酚具有抗菌抗病毒、抑制生物被膜形成等作用[14-15]。檸檬醛存在于楓茅油和山蒼子油中，是開鏈單萜類物質(zhì)。有研究證實(shí)，檸檬醛可以通過與某些酶結(jié)合，影響微生物代謝系統(tǒng)，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及其生物被膜形成[16]。肉桂醛天然存在于桂皮油、藿香油當(dāng)中，也有研究證明，肉桂醛可以通過破壞細(xì)胞壁，抑制細(xì)菌DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用[17-18]。在本研究中，選取了金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及沙門氏菌作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，這三種菌都是常見的食源性細(xì)菌，同時(shí)也是國(guó)內(nèi)食品污染以及腐敗的常見細(xì)菌[19]。多項(xiàng)研究證明，這三種細(xì)菌都可以通過形成生物被膜結(jié)構(gòu)增加其對(duì)于不利環(huán)境的抗性，使其在工業(yè)生產(chǎn)以及家庭衛(wèi)生環(huán)境中的變得更難清除[20-2]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，3種天然食品添加劑對(duì)于3種細(xì)菌均具有抑制作用，同時(shí)也會(huì)抑制其生物被膜形成。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)于金黃色葡萄球菌的菌體生長(zhǎng)以及生物被膜形成抑制效果更好，肉桂醛更趨向于抑制大腸桿菌和沙門氏菌的菌體生長(zhǎng)和生物被膜形成，這可能是由于AI-2活力引起的。實(shí)驗(yàn)證明，肉桂醛可以抑制大腸桿菌和沙門氏菌的AI-2活力，從而減少其生物被膜形成，而對(duì)金黃色葡萄球菌的AI-2并無抑制效果，因此對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力抑制效果較弱。檸檬醛則是由于其對(duì)于三種細(xì)菌的AI-2活力均有抑制，使其對(duì)于革蘭氏陽性菌和陰性菌的生物被膜形成都有一定的抑制效果，而茶多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌以及混合菌的生物被膜形成能力均有抑制作用。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其只對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌以及混合菌AI-2活力具有抑制作用，推測(cè)可能是由于茶多酚具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以額外通過影響生物被膜中脂質(zhì)、多糖等胞外產(chǎn)物來抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成[4]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了3種天然添加劑對(duì)3種細(xì)菌及其混合菌的生物被膜形成及其AI-2信號(hào)分子的抑制作用，在今后的研究中，我們將進(jìn)一步研究加入不同添加劑后，生物膜中各種蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)等的含量變化，以探討各種食品添加劑抑制細(xì)菌生物被膜形成的作用機(jī)理。

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