王 偉，王世英，郭曉軍，李 佳，朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

β-葡聚糖作為植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，廣泛存在于燕麥、大麥、黑麥、小麥等麥類作物中。常見(jiàn)麥類作物中，燕麥和大麥β-葡聚糖含量較高，其中燕麥含量最高。β-葡聚糖是限制麥類有效利用的主要因素，因此常使用β-葡聚糖酶來(lái)有效分解麥類植物胚乳細(xì)胞壁中的β-葡聚糖，以降低飼料中非淀粉多糖（NSP）及其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，從而提高飼料的消化率，促進(jìn)禽畜的生長(zhǎng)（劉雨田等，2000）。 翟曉莉（2012）研究表明，在大麥型豬飼糧中添加β-葡聚糖酶，會(huì)使日增重提高5%～45%，飼料報(bào)酬率提高3%～15%。李春燕等（2012）在肉雞飼料中分別添加0.1%和0.2%的β-葡聚糖酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉雞日增重提高了10.45%和15.31%，料肉比降低了9.64%和10.84%，差異均顯著。

本研究利用剛果紅平板法作為篩選模型，從動(dòng)物糞便中分離和篩選高產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，從而對(duì)其進(jìn)行鑒定，為今后該菌株在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供良好基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試樣品 動(dòng)物糞便，取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物標(biāo)本園。

1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基的配制詳見(jiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》（程麗娟和薛泉宏，2000）。

分離和初篩培養(yǎng)基：β-葡聚糖 0.1 g，剛果紅0.04 g，蛋白胨 1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g，瓊脂 1.5 ～ 2.0 g，蒸餾水 100 mL，pH 7.0，121℃滅菌 20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：β-葡聚糖0.1 g，蛋白胨1.0 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.01 g，CaCl20.04 g， 蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.3 生理生化鑒定 生理生化鑒定試劑參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》東秀珠和蔡妙英（2001）。

1.4 DNA提取和16s rDNA基因擴(kuò)增所用試劑TE 緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）；1 mmoL EDTA （pH 8.0）；SDS 提 取 緩 沖 液 ：100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）；20 mmol/L EDTA；10%SDS；1.4 mol/L NaCl；Tris 飽和酚+氯仿 （25∶24，V/V）；50 mg/mL溶菌酶溶液；1mg/mL RNase A；1%瓊脂糖 凝 膠 ；70 ng/μL DNA 模 板 ；2.5 mmol/L dNTP Mixture；10×ExTaq Buffer （Mg2+pluse ）；20 μmol/L 27F；20 μmol/L 1495F；ExTaq DNA 聚合酶。

2 方法

2.1 樣品的采集和處理 選取新鮮兔子的糞便約150 g，裝入滅菌后的塑料袋內(nèi)。4℃冰箱中保存。

2.2 分離和初篩 稱取兔子糞便10 g，放入含90 mL無(wú)菌水和十幾粒玻璃珠的250 mL三角瓶中，搖床200 r/min旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)10 min，使成均勻的10-1g/mL菌懸液，置80℃水浴20 min，然后進(jìn)行10 倍梯度稀釋。選取 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等稀釋梯度，涂布在初篩培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～5 d后觀察并挑取能夠在初篩培養(yǎng)基平板形成透明圈的菌落，在NA培養(yǎng)基平板上劃線純化后，連續(xù)重復(fù)3次點(diǎn)接在初篩培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，挑取透明圈直徑和菌落直徑比值較大的菌落，37℃培養(yǎng)1～2 d后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 β-葡聚糖酶活力測(cè)定 配制液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH至7.0，分別倒入250 mL三角瓶，裝液量為50 mL，分別接入初篩得到的具有較大水解圈的菌株，37℃條件下220 r/min旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液經(jīng)4℃、10000 r/min離心5 min，取清液，備用。

2.3.1 測(cè)定原理 β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解成寡糖和單糖。具有還原性末端的寡糖和有還原基團(tuán)的單糖在沸水浴條件下可以與DNS試劑發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，而還原糖的生成量又與反應(yīng)液中β-葡聚糖酶的活力成正比。因此，通過(guò)分光比色測(cè)定反應(yīng)液顏色的強(qiáng)度，可以計(jì)算反應(yīng)液中β-葡聚糖酶的活力。

在37℃、pH為5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

2.3.2 測(cè)定方法 β-葡聚糖酶活力采用分光光度法測(cè)定（NY/T 911-2004）。以菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶活力的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選酶活力較高的菌株作為微生物發(fā)酵消除谷物中抗?fàn)I養(yǎng)因子的供試菌株。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定 菌落形態(tài)觀察：挑取少量NA斜面上30℃培養(yǎng)24 h的T-4-3菌株至裝有10 mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻后取1 mL至裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，依次稀釋得到不同濃度的菌懸液。分別取10-4、10-5稀釋梯度的稀釋液0.1 mL涂布NA培養(yǎng)基平板，然后倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。

菌體形態(tài)觀察：挑取NA斜面上30℃培養(yǎng)24 h的T-4-3菌株，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

2.4.2 生理生化鑒定 參照 《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）的方法對(duì)T-4-3菌株分別進(jìn)行接觸酶，V.P測(cè)定，淀粉水解，硝酸鹽還原，亞硝酸鹽還原，檸檬酸鹽利用，明膠液化，甲基紅試驗(yàn)，纖維素分解，酪素水解，吲哚試驗(yàn)，丙二酸鹽利用，耐鹽性試驗(yàn)，糖、醇類發(fā)酵，生長(zhǎng)溫度等生理生化試驗(yàn)。

2.4.3 DNA提取和16S rDNA基因擴(kuò)增 參考Kim 等（1995）和 Rainey 等（1996）的方法提取細(xì)菌總DNA。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待鑒定菌株的發(fā)酵液1.5 mL，8000 r/min 離心去菌體。懸于 400 μL TE 緩沖液，加入50 mg/mL的溶菌酶溶液20 μL，37℃過(guò)夜溫育。加入400 μL SDS提取緩沖液，65℃溫育45 min，冷卻至室溫，加入400 μL的Tris飽和酚+氯仿（25∶24，V/V），混勻后 12000 r/min 離心 10 min，上相用等體積的氯仿抽提，混勻后12000 r/min離心，10 min后上相用1倍體積冰冷的異丙醇沉淀DNA，-20℃靜置30 min，室溫干燥后溶于200 μL TE 緩沖液，加入 20 μL RNAase（1 mg/mL），37℃，30 min。室溫干燥后溶于30 μL TE緩沖液，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，估計(jì)提取的DNA濃度。

引物為通用引物 （Lane，1991）， 正向引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。 反向引物為 1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。分別位于16S rDNA的8～27和1495～1514位的堿基片段 （以Escherichia coli的16S rDNA堿基位置為準(zhǔn)）。

PCR 反應(yīng)體系：DNA（70 ng/μL）模板 2 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1495F （20 μmol/L）1.5 μL；10 ×ExTaq Buffer （Mg2+pluse）5 μL；ExTaq DNA 聚合酶 0.2 μL；補(bǔ)足 ddH2O 至 50 μL。

PCR條件為：94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72℃延伸 3 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后測(cè)序。

2.4.4 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制將所測(cè)得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性分析，并與GenBank中的相近序列在Clustal X（1.8）程序包中進(jìn)行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，最后形成一個(gè)多重序列匹配排列陣，其中形成的缺口用“-”填補(bǔ)，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Saitou 和 Nei，1987）。

3 結(jié)果與分析

3.1 初篩 本試驗(yàn)以是否能水解β-葡聚糖從而在剛果紅平板上產(chǎn)生水解圈來(lái)判定是否為產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株，共篩選出菌株28株，水解圈直徑與菌落直徑比在2.0以上的菌株有16株，5.0以上的菌株有4株，分別是T-4-2、T-4-3、D-5-1、L-3-9，其中D-5-1的直徑比最高，達(dá)到13.09，如表1所示。

表1 初篩所得菌株的直徑

3.2 β-葡聚糖酶活力測(cè)定 將初篩所得菌株在液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。采用DNS法定量測(cè)定發(fā)酵后上清液的酶活力。其中酶活力在4.0 U/mL以上的有14株，結(jié)果如表2所示，其中 T-4-3菌株酶活力最高，達(dá)到21.9 U/mL。

表2 菌株產(chǎn)酶活力 U/mL

3.3 菌株T-4-3的鑒定

3.3.1 菌落形態(tài) 菌株在NA平板上生長(zhǎng)，單菌落呈近圓形，邊緣整齊，中央隆起，不透明，近白色，表面光滑。

3.3.2 菌體形態(tài) 在NA試管斜面上培養(yǎng)24 h的菌體進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，革蘭氏陽(yáng)性，芽孢呈橢圓形中生，菌體具抗酸性，可產(chǎn)生異染粒，菌體生長(zhǎng)物向四周呈云霧狀擴(kuò)散。

3.3.3 生理生化試驗(yàn)結(jié)果 按 《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）中的方法進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 T-4-3菌株的生理生化特征

綜合以上T-4-3菌株的形態(tài)特征和生理生化特性，對(duì)照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行檢索，初步將其鑒定為芽孢桿菌屬。

3.3.4 T-4-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析 為進(jìn)一步確定T-4-3菌株的分類學(xué)地位，需測(cè)定其16S rDNA基因序列。經(jīng)測(cè)定，T-4-3菌株序列長(zhǎng)度為1448 bp。將T-4-3菌株的16S rDNA基因序列在GenBank中進(jìn)行Blast相似性分析，并將Genbank中與T-4-3菌株相似性較高的7個(gè)菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖1和表4所示，供試菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源相似度大部分在99%以上；T-4-3菌株與CP000560 Bacillus amyloliquefaciens和AY603658 Bacillus velezensis序列相似性高達(dá)100%。綜合以上T-4-3菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列的分析結(jié)果，鑒定T-4-3菌株為Bacillus amyloliquefaciens。

圖1 T-4-3菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表4 T-4-3菌株與幾種標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比較

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用剛果紅平板法初篩和搖瓶復(fù)篩相結(jié)合的方法從動(dòng)物糞便中分離和篩選到一株β-葡聚糖酶活力較高的菌株T-4-3，酶活力達(dá)到21.9U/mL。對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化特征分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.），將其16S rDNA序列與GeneBank中已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并用Neighbor-joining方法構(gòu)建菌株T-4-3進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，T-4-3與標(biāo)準(zhǔn)菌株CP000560 Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支，同源性高達(dá)100%。

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