殷 紫 張二飛 武小月

（1.淮陰衛(wèi)生高等專科學(xué)校，江蘇 淮安 223300；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223300）

丹參是唇形科鼠尾草屬植物，因其種子發(fā)芽率低，所以一般不采用種子繁殖[1]。發(fā)育不良、種子發(fā)芽率低和品質(zhì)退化是導(dǎo)致丹參成活率和產(chǎn)量較低的主要原因。近年來，隨著丹參越來越多的被人們應(yīng)用于臨床試驗,大量的丹參遭到人們的挖采，丹參資源日益減少，有些稀有品種已瀕臨滅絕。丹參具有豐富的藥理作用。能有效的治療冠心??；抑制體外腫瘤細(xì)胞的增殖[2]；具有抗菌消炎的作用[3]；是醫(yī)治心腦血管系統(tǒng)疾病不可或缺的藥物。

多倍體藥用植物一般具有根、莖、葉和花果的巨型性,抗逆性強(qiáng),藥用成分含量高等特性,這正是藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)育種所期望達(dá)到的目標(biāo)[4]。多倍體誘導(dǎo)的方法有很多。取得了不錯應(yīng)用效果。石蔭坪[5]利用棗子的胚乳，培養(yǎng)出了三倍體苗木。胚乳培養(yǎng)缺點就是愈傷組織繼代培養(yǎng)時會出現(xiàn)變異的染色體，最后會出現(xiàn)雜合體、嵌合體、二倍體的再生植株。陳柏君[6]等誘導(dǎo)黃芩同源四倍體時采用組織培養(yǎng)的方法先獲得愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生芽，當(dāng)培養(yǎng)基上長出綠色芽點時，將帶芽點的愈傷組織置于含有秋水仙素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，或放入秋水仙素水溶液中浸泡，最后依次經(jīng)分化及生根培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得再生植株。陳素萍.等也利用組織培養(yǎng)技術(shù)成功誘導(dǎo)了黨參多倍體，獲得了大批量的再生植株。

1 實驗材料、試劑和儀器

1.1 實驗材料

丹參的幼苗；葉片；愈傷組織

1.2 實驗試劑

1）娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；批號：220930規(guī)格：1.25L/瓶；

2）秋水仙素，上海谷研科技有限公司生產(chǎn)；CAS號：64-86-8 規(guī)格：25g/瓶；

3）卡諾固定液，上海君瑞生物科技有限公司；貨號：JR00936 規(guī)格：100M；

4）混和酸(45%醋酸,1mol 鹽酸，l%硫酸銨100,10:1 混和)；

5）70%和95%的酒精；

6）75%的乙醇。

1.3 實驗儀器

普通光學(xué)顯微鏡 拓豐儀器科技(上海）有限公司

2 實驗方法

2.1 培養(yǎng)基配制

2.1.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

分化培養(yǎng)基:2 mg·L-1細(xì)胞分裂素(6-BA)+MS+7g·L-1瓊脂+0.2 mg·L-1生長素（IAA）+3%蔗糖;誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基:2mg·L-1細(xì)胞分裂素（6-BA）+MS+0.2mg·L-1生長素2,4-D+7 g·L-1瓊脂+3%蔗糖;生根培養(yǎng)基:0.2 mg·L-1生根粉ABT+1/2MS+7g·L-1瓊脂+2%蔗糖。培養(yǎng)條件是在25℃左右。

2.2 秋水仙素配制方法

將秋水仙素直接放在冷水中進(jìn)行溶解，或者先把它放在少量的酒精中進(jìn)行溶解，然后加入冷水。配制好的溶液應(yīng)放在棕色玻璃瓶中進(jìn)行貯存，并且把瓶子放在暗處，避免陽光直射，此外瓶蓋應(yīng)擰緊，以減少與空氣的接觸，防止藥效揮發(fā)。

2.3 檢測方法

丹參的多倍體形成完整植株后，切去0.5 cm 的根尖,采用文獻(xiàn)[9]的方法對根尖進(jìn)行染色體鑒定。起初將切好的根尖用蒸餾水清洗3 次,放進(jìn)0.1%秋水仙堿溶液中處理1.5 h,取出后用蒸餾水再洗3 次,放進(jìn)卡諾固定液中固定2 h,然后分別用95%與70%乙醇、蒸餾水各洗3次,再用混和酸(45%醋酸、1mol/L 鹽酸、l%硫酸按100:10:1 混和)在室溫下離析80min,最后水洗3 次,放入70%乙醇中保存，最后進(jìn)行鏡檢。

2.4 多倍體誘導(dǎo)

開始誘導(dǎo)丹參多倍體,通過三種方法從秋水仙素劑量、處理方法和處理時間三個方面來對比研究觀察。

2.4.1 幼苗處理法

將濃度為30,40,50mg/L 的秋水仙素過濾滅菌后加入分化培養(yǎng)基,將長1.5～2cm 丹參幼苗轉(zhuǎn)入該培養(yǎng)基中,分別料理5,7,10d,各3 次重復(fù),每組處理50 株。移到生根培養(yǎng)基之后,開始1 周轉(zhuǎn)繼1 次,轉(zhuǎn)2 次后間隔的時間可加長。

2.4.2 葉片處理法

參照文獻(xiàn)[10]等的培養(yǎng)方法,將帶柄的丹參幼葉切成0.2cm2的小塊接種于分化培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)1 周后，分別轉(zhuǎn)入加有不同含量(5,10,15,20 mg·L-1)秋水仙素的分化培養(yǎng)基中處理1 周或2 周后，再轉(zhuǎn)入無秋水仙素的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，各設(shè)3 次重復(fù)，每次處理50 個切塊。

2.4.3 愈傷組織處理法

將帶柄丹參幼葉切成0.2cm2的小塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，當(dāng)愈傷組織長出后切割成4～5mm2大小轉(zhuǎn)入加有5,10,15,20mg/L 秋水仙素的分化培養(yǎng)基中1 周或2 周處理后，然后轉(zhuǎn)移到?jīng)]有加秋水仙素的分化培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，各設(shè)3 次重復(fù)，每處理50 個切塊。

3 結(jié)果與分析

表1 秋水仙素在不同濃度時處理丹參幼苗的加倍效果

實驗結(jié)果表明：在幼苗處理法中,多倍體出現(xiàn)的頻率并不隨含量的增加和處理時間的增加而增加。但是秋水仙堿的劑量和處理時間對幼苗加倍率有著非常大的影響。其中40 mg/L 秋水仙堿處理5 d 的效果最明顯,幼苗加倍率12%。

實驗結(jié)果表明：秋水仙堿的培養(yǎng)基中處理1～2 周,都有利于多倍體的生成,處理時間對加倍率沒有明顯規(guī)律影響；不同劑量存在非常明顯的差異，隨著秋水仙堿劑量的增加而增加,但當(dāng)增加到一定劑量時,誘變率反而降低,從產(chǎn)生多倍體頻率來看15 mg/L 處理1 周的效果最好,加倍率最高達(dá)34.13%。

表2 秋水仙素在不同濃度時處理丹參葉片的加倍效果

表3 秋水仙素在不同濃度時處理丹參愈傷組織的加倍效果

實驗結(jié)果表明：15 mg/L 處理1 周的效果最好,加倍率最高達(dá)33.23%.但由于需首先誘導(dǎo)出愈傷組織再進(jìn)行分化，所需時間較葉片法長(表3)。誘導(dǎo)丹參多倍體的3 種方法中頻率隨外植體、處理時間、秋水仙素劑量的不同誘導(dǎo)效果均有不同。處理時間越短、秋水仙素劑量越低、分化率雖高,但加倍率低；處理時間越長，秋水仙素劑量越高、外植體成活率越低，分化率及加倍率亦隨之降低。因此要得到較高的加倍率和保持較高的成活率,選擇合適的外植體、處理時間和秋水仙素劑量是非常重要的。

4 討論

利用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體育種，方便、經(jīng)濟(jì)、專一性強(qiáng)。秋水仙素實際上是一種抑制劑，其主要作用機(jī)理是抑制紡錘體的形成，使染色體不能移向兩極，從而實現(xiàn)體內(nèi)染色體的加倍，得到多倍體的植物。但對于不同的外植體,誘導(dǎo)效果不同。實驗證明,要想得到最好的誘導(dǎo)方法應(yīng)該把處理時間和秋水仙素的劑量組合起來,篩選出最佳處理時間和秋水仙素劑量；本實驗中將秋水仙素加入培養(yǎng)基中采用幼苗、葉片和愈傷組織三種不同的外植體進(jìn)行誘導(dǎo)。得出結(jié)論，用15 mg/L 秋水仙素處理1 周的葉片和愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，可達(dá)34.13%和33.23%，而對幼苗的誘導(dǎo)最高只有12%左右，說明早期誘導(dǎo)比成苗后誘導(dǎo)效果好。在愈傷組織處理法中由于需首先誘導(dǎo)出愈傷組織再進(jìn)行誘導(dǎo)分化，所以所需時間比葉片處理法長，最終表明葉片處理法加入15 mg/L 秋水仙素處理1 周誘導(dǎo)的多倍體效果最好。

［1］中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所,等.中藥志(第一冊) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1979：339－349.

［2］黃韌敏,袁淑蘭,宋琦，等.丹參酮誘導(dǎo)HL -60 細(xì)胞分化及凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析[J].中國腫瘤臨床,1997,24(7):500－500.

［3］房其年,張佩玲,徐宗沛.丹參抗菌有效成分的研究[J].化學(xué)學(xué)報,1976,34(3):197－208.

［4］張愛民,常莉,薛建平.藥用植物多倍體研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2005,30(9):645－645.

［5］石蔭坪.棗胚乳三倍體的育成及生物學(xué)細(xì)胞研究[J].山東果樹,1985,(1):1-3.

［6］陳柏君,高山林,卞云云.黃芩組織培養(yǎng)同源四倍體的誘導(dǎo)[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2000,9(1):9-11.

［7］陳素萍,王莉,宋秀清.黨參多倍體育種的研究[J].中草藥,1991,22(5):224-227.