王東升，辛 紅，邢世巖，李際紅，劉曉靜，吳岐奎

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安271018)

紫椴(Tilia amurensis Ruprecht)是椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tilia L.)高大落葉喬木樹種，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物［1］.由于對(duì)紫椴大規(guī)模采伐及其繁育困難，其數(shù)量逐年下降，許多優(yōu)良種質(zhì)資源消失，導(dǎo)致紫椴資源遺傳多樣性不斷下降，遺傳基礎(chǔ)變得相對(duì)狹窄.目前對(duì)紫椴的研究主要集中在育種造林［2］、生態(tài)學(xué)［3］、木材結(jié)構(gòu)［4］、優(yōu)良無(wú)性系選擇［5］等方面，在分子水平上的研究還不多.穆立薔等［6］通過ISSR技術(shù)對(duì)紫椴6個(gè)種群125個(gè)個(gè)體進(jìn)行多樣性檢測(cè)，結(jié)果表明總的多樣性為93.85%，其具有較高的遺傳多樣性.劉贏男［7］通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)紫椴6個(gè)種群90個(gè)個(gè)體進(jìn)行多樣性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)供試材料也具有較高的遺傳多樣性.林木基因資源是林木育種及林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過對(duì)紫椴進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建聚類樹，以了解其系統(tǒng)發(fā)育，明確各種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，最大效率進(jìn)行種質(zhì)資源的收集保存.AFLP方法多樣性高、重復(fù)性好［8］，因此，本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)山東省5個(gè)地區(qū)收集的紫椴進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，以期為紫椴種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、早期選育、保存與保護(hù)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年5月上旬采集泰山后石塢(編號(hào)1－20)、嶗山北九水(編號(hào)21－25)、魯山雨林(編號(hào)26－30)、艾山南官山(編號(hào)31－42)、昆崳山環(huán)山路(編號(hào)43－62)的野生紫椴的正常生長(zhǎng)、無(wú)病斑嫩葉，作為供試材料，共62份.每份材料單株采集，單株間相距10 m以上.用裝有變色硅膠的自封袋加以封存，封存過程中翻動(dòng)2－3次，以保證葉片在12 h內(nèi)達(dá)到完全干燥，用于DNA的提取.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA制備 稱取紫椴完全干燥葉片約50 mg，參照洪丕征［9］的CTAB法提取DNA.

1.2.2 AFLP體系的建立 酶切采用雙酶切(PstⅠ和MseⅠ)，與連接同時(shí)進(jìn)行，加入DNA模板200 ng、1 μL Adapter(10 mmol·L－1.PstⅠ接頭:5'＞ CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA ＜ 3'，5'＞ TGT ACG CAG TCT AC ＜3'.MseⅠ接頭:5'＞ GAC GAT GAG TCC TGA G ＜3'，5'＞ TAC TCA GGA CTC AT ＜3')、2 μL PstⅠ/MseⅠ(5 U·μL－1)、1 μL T4 Ligase(5 U·μL－1)等構(gòu)建20 μL 反應(yīng)體系.將此體系在37 ℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃下過夜.

以2 μL 酶切連接后的 DNA 產(chǎn)物為模板，加入 1 μL 預(yù)擴(kuò)引物(10 μmol·L－1，PstⅠ 5'＞ GAC TGC GTA CAT GCA G ＜3'，MseⅠ 5'＞GAT GAG TCC TGA GTA A C ＜3')、0.5 μL Taq 酶(2 U·μL－1)等，構(gòu)建25 μL預(yù)擴(kuò)增體系.PCR擴(kuò)增程序?yàn)?在94℃預(yù)變性2 min，隨后經(jīng)過94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸80 s，持續(xù)30個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸5 min.

預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍后作為選擴(kuò)模板，加入篩選出的10 μmol·L－1的PstⅠ引物和MseⅠ引物各1 μL，0.5 μL的Taq酶(2 U·μL－1)構(gòu)建25 μL的選擴(kuò)增體系.按以下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，共擴(kuò)增12輪;接著進(jìn)行94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸80 s，擴(kuò)增23輪;然后72℃延伸5 min;最后將選擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行4%聚丙烯酰胺電泳，得到電泳圖.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 電泳圖經(jīng)ABI 377 PRISM 377 sequencer測(cè)序儀檢測(cè)片段大小，采用GENESCAN軟件進(jìn)行分析，擴(kuò)增后清晰可辨的條帶記為“1”，無(wú)帶的記為“0”，構(gòu)建“01”矩陣，以供下一步分析.利用POPGENE version 1.31軟件計(jì)算多態(tài)帶比例(PPB)、觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、觀測(cè)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's基因多樣性(H)、Shannon's信息指數(shù)(I).采用NTSYSpc version 2.10e軟件，得到相似系數(shù)SC矩陣.采用Dice系數(shù)非加權(quán)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行紫椴的聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫椴的AFLP分析

對(duì)9對(duì)多態(tài)性較好的引物進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)，共獲得1374個(gè)條帶，其中1370條為多態(tài)帶，平均多態(tài)帶比率為99.70%(表1)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生152條多態(tài)帶.引物不同則擴(kuò)增效率不同.產(chǎn)生多態(tài)帶數(shù)量最少的引物是P-GAA/M-CAA，共擴(kuò)增出127條;產(chǎn)生多態(tài)帶最多的引物是P-GAC/M-CAG，達(dá)171條.不同引物的多態(tài)帶百分率為99.20%－100.00%，說(shuō)明AFLP標(biāo)記在所分析的紫椴資源中多態(tài)性較好，是檢測(cè)紫椴遺傳多樣性的一種有效技術(shù).檢測(cè)出位點(diǎn)遺傳多樣性指標(biāo) Na、Ne、H 和 I分別為1.9969、1.3404、0.2132、0.3405，均較大，顯示紫椴遺傳多樣性較高，遺傳變異相對(duì)廣泛.

圖1P-GAT/M-CTA擴(kuò)增的紫椴AFLP圖譜Fig.1 AFLP profiles for singal plants of T.amurensis by P-GAT/M-CTA

表1 62個(gè)紫椴單株AFLP引物的多態(tài)性Table 1 The strip polymorphism of 62 single plants of T.amurensis after AFLP selective amplification

2.2 紫椴的特異性條帶

62個(gè)紫椴單株中有51個(gè)單株擴(kuò)增出182條特異性條帶，占多態(tài)帶總數(shù)的13.3%，其中缺失帶為6條.56號(hào)單株擴(kuò)增的特異性條帶最多，達(dá)到12條，包括1條缺失帶;其次是51號(hào)單株，擴(kuò)增出11條特異性條帶，56號(hào)和51號(hào)單株都來(lái)自昆崳山.通過特異性條帶可將82.3%的紫椴單株辨別出來(lái)，說(shuō)明AFLP技術(shù)在種質(zhì)鑒定方面具有巨大潛力.9對(duì)引物擴(kuò)增出的特異性條帶數(shù)為11－24，其中P-GAT/M-CAA擴(kuò)增出的特異性條帶最多，達(dá)到24條;其次是 P-GAC/M-CAC、P-GAC/M-CAG、P-GAC/M-CT、P-GAT/M-CTA，都擴(kuò)增出了23條特異性條帶;擴(kuò)增出特異性條帶最少的是P-GAA/M-CAA，僅有11條.擴(kuò)增出的條帶數(shù)量表明不同引物組合通過特異性條帶鑒別種質(zhì)有效性的高低.

2.3 紫椴的遺傳相似性及其聚類分析

采用NTSYSpc version 2.10e軟件檢測(cè)62個(gè)紫椴單株間的相似性，相似系數(shù)為0.3911－0.7953，平均值為0.5761.1號(hào)與2號(hào)的相似性系數(shù)最大，說(shuō)明1號(hào)與2號(hào)的親緣關(guān)系最近，這可能與這兩者來(lái)源地相同有關(guān)，它們都來(lái)自泰山后石塢.來(lái)自泰山的12號(hào)與來(lái)自昆崳山的56號(hào)的相似性系數(shù)最小，說(shuō)明這兩者間的相似性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與它們來(lái)源地相距較遠(yuǎn)、生長(zhǎng)條件差異性較大有關(guān).

對(duì)62個(gè)紫椴單株進(jìn)行UPGMA聚類，在相似性系數(shù)為0.60處，將其分成12組.第1組包括1、2、3、7、10、11、12、14、15、17、18、19、20、31 號(hào)，共 14 個(gè)單株，其中來(lái)自泰山的有 13 個(gè)單株，來(lái)自艾山的有 1 個(gè)單株;第2 組包括5、6、13、21、22、23、24、25、26、28、30、37 號(hào)，共 12 個(gè)單株，來(lái)自泰山的有 3 個(gè)單株，魯山的有3 個(gè)單株，艾山的有1 個(gè)單株，嶗山的有 5 個(gè)單株;第 3 組包括 32、33、34、35、36、38、39、40、41、42、43、44、46、47、49、50、51、52、53、55、58、59、61、62 號(hào)，共24 個(gè)單株，其中來(lái)自艾山的有 10 個(gè)單株，來(lái)自昆崳山的有14個(gè)單株;第4組包括4、9、16號(hào)，共3個(gè)單株，均來(lái)自泰山;第5－9組各包括1個(gè)單株，分別是來(lái)自泰山的8號(hào)、昆崳山的54號(hào)、昆崳山的60號(hào)、昆崳山的57號(hào)、魯山的27號(hào);第10組包括來(lái)自魯山的29號(hào)和來(lái)自昆崳山的48號(hào)單株;第11、12組各包括1個(gè)單株，分別是來(lái)自昆崳山的45號(hào)單株和來(lái)自昆崳山的56號(hào)單株.通過聚類分析可知，來(lái)源相同的單株并沒有嚴(yán)格地聚成一組，說(shuō)明親緣關(guān)系與來(lái)源沒有嚴(yán)格的一致關(guān)系.來(lái)自昆崳山的紫椴分散在7個(gè)組中，說(shuō)明昆崳山的紫椴變異范圍較廣泛.

3 小結(jié)與討論

本研究通過9對(duì)AFLP引物組合獲得了千余條穩(wěn)定而有效的條帶，這充分驗(yàn)證了AFLP標(biāo)記方法的可靠性、穩(wěn)定性和高效性.此外，采用機(jī)器讀帶，避免了人工讀帶誤差大的缺點(diǎn)，精確性大大提高.一般認(rèn)為，P值超過50%，則認(rèn)為該物種具有較豐富的遺傳多樣性［10］.本研究檢測(cè)的紫椴遺傳多樣性達(dá)到99.70%，比劉贏男［7］和穆立薔等［6］通過ISSR技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果都高，這可能與采用的方法不同有關(guān).AFLP被認(rèn)為是迄今為止最有效的分子標(biāo)記［11］.另外，供試材料的來(lái)源、樣本的大小都會(huì)對(duì)遺傳多樣性造成一定影響.遺傳多樣性能夠反映一個(gè)物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力、生存能力.有的學(xué)者認(rèn)為，特有或?yàn)l危物種具有較低的遺傳多樣性［12－13］.但更多的研究報(bào)道卻揭示，稀有或?yàn)l危種并未表現(xiàn)出遺傳變異水平的下降，有些特有種甚至瀕危種也可能具有較高的遺傳多樣性［14－16］，本研究也證明了這一點(diǎn).因此單憑遺傳多樣性不能夠準(zhǔn)確而充分地反映種群的生存狀態(tài)，為進(jìn)一步揭示遺傳多樣性與物種保護(hù)之間的關(guān)系，還需要將形態(tài)生理、生態(tài)學(xué)、分子水平的相關(guān)研究綜合起來(lái)進(jìn)行分析.

圖2 62個(gè)紫椴單株基于AFLP分析的UPGMA聚類結(jié)果Fig.2 Dendrogram of UPGMA analysis of 62 signal plants of T.amurensis based on AFLP markers

51個(gè)單株擴(kuò)增出了182條特異性條帶，占多態(tài)帶總數(shù)的13.3%，其中缺失帶為6條，可將82.3%的紫椴單株辨別出來(lái).特異性條帶是某個(gè)單株的特有帶，是進(jìn)行特殊性狀標(biāo)記的基礎(chǔ).因此，可利用特異性條帶進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定.這比依據(jù)表型性狀進(jìn)行種質(zhì)資源分類更加全面和精確，更能真實(shí)反映不同種質(zhì)資源間的遺傳背景和遺傳差異.此外，通過比較條帶存在與否、條帶的數(shù)量可發(fā)現(xiàn)不同紫椴單株之間遺傳多樣性和親緣關(guān)系.差異帶數(shù)越多，單株間的遺傳相似性越低，遺傳多樣性越豐富，親緣關(guān)系越遠(yuǎn);反之，則相似性越大，親緣關(guān)系越近［17］.特異性條帶的存在還可能與種質(zhì)資源對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力有一定聯(lián)系，可以作為基因資源保護(hù)的一個(gè)依據(jù).

聚類分析一定程度上可以反映種質(zhì)資源的起源和分類［18］.62個(gè)單株相似系數(shù)為0.3911－0.7953，平均值為0.5761，在相似性系數(shù)為0.60處，可將所有單株分成12組，從個(gè)體的聚類圖上可以看出:來(lái)源相同的紫椴單株不能完全按照地域聚類.不同地區(qū)的紫椴在聚類圖中也沒有明顯界限，來(lái)源于昆崳山的種質(zhì)分布于7個(gè)組中，表明供試?yán)Ｉ阶祥卜N質(zhì)存在著較寬的遺傳基礎(chǔ).這可能是紫椴的起源和親緣關(guān)系較為復(fù)雜所致，也可能是因?yàn)榈貐^(qū)之間紫椴的廣泛交流導(dǎo)致了某些基因在不同地區(qū)種質(zhì)間的滲入.

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