劉思思， 杜 鵑， 陳景文， 趙洪霞

（工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連116024）

抗生素是一類對細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體等致病微生物具有抑制或殺滅作用的天然、半合成或完全人工合成的藥物，被廣泛用于臨床醫(yī)療、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)。我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，2009 年產(chǎn)量已達14.7 萬噸［1］。我國也是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖總產(chǎn)量占全世界的61.4%［2］。養(yǎng)殖過程中，大量的抗生素被作為生長促進劑添加到飼料中來促進動物的生長發(fā)育，提高產(chǎn)量，而海水養(yǎng)殖排出的污水往往未經(jīng)處理直接排入大海，造成嚴(yán)重的抗生素污染。迄今已有約68 種抗生素在我國的地表水環(huán)境中被檢出［3］。由于其“假持久性”，這些抗生素進入環(huán)境后，易殘留在動物源性食品中，有潛在的生態(tài)風(fēng)險。已有研究表明，磺胺類等抗生素會導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性［4］，且具有潛在的致癌性［5］。因此監(jiān)測水生生物體內(nèi)抗生素殘留對生態(tài)風(fēng)險評價及食品安全具有重要意義。

目前，國內(nèi)外對生物樣品中抗生素的前處理方法主要有超聲輔助萃?。?］、酶聯(lián)免疫法［7］、加壓溶劑萃?。ˋSE）［8-10］等，樣品再經(jīng)固相萃取柱富集凈化。超聲輔助萃取法提取效率高、省時、能耗低等優(yōu)點，但重復(fù)性較差。酶聯(lián)免疫法基于抗原抗體特異性原理，簡單、快速、靈敏、特異性強，但不適合用于多種抗生素殘留檢測，且容易出現(xiàn)假陽性。ASE 法能在較高的溫度和壓力下選擇合適的溶劑，高效、快速地萃取固體或半固體樣品中的待測物。與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，ASE 技術(shù)具有萃取效率高、萃取時間短、所需溶劑用量少等優(yōu)點，且被美國環(huán)境保護署（EPA）選定為推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）由于具有選擇性高、靈敏度高等特點，已成為目前國內(nèi)外抗生素檢測的常用方法［11-14］。厲文輝等［15］采用ASE-LC-MS／MS 方法對魚肉中喹諾酮、磺胺和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行了分析，但其前處理方法仍較為繁瑣。國內(nèi)外關(guān)于魚肉中多種抗生素殘留的分析方法還有待研究。因此，本文建立了一種快速簡便的魚肌肉中多種抗生素殘留的HPLC-MS／MS 檢測方法，樣品經(jīng)ASE 萃取后只需進行冷凍離心去除極性脂肪等雜質(zhì)即可直接進行分析，省去了樣品前處理中的凈化步驟，不僅提高了樣品處理的通量，還減小了由于操作過程中的錯誤和可變因素而帶來的誤差。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC1100-6410B，美國Agilent 公司）；加速溶劑萃取儀（ASE 350，美國Dionex 公司）；聚丙烯離心管（30 mL，美國Nalgene 公司）；馬弗爐（4-10，沈陽市節(jié)能電爐廠）；臺式高速冷凍離心機（德國Thermo 公司）；氮吹儀（HGC-12，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺甲嘧啶（sulfamerazine）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim）、乙?；前愤拎ぃ∟-4-acetyl-sulfapyridine）、磺胺二甲嘧啶（sulfadimidine）、磺 胺 甲 惡 唑（sulfamethoxazole）、乙酰磺胺甲惡唑（N-4-acetyl-sulfamethoxazole）、磺胺地索辛（sulfadimethoxine）、磺胺氯噠嗪（sulfachlorpyridazine）、依諾沙星（enoxacin）、左氧氟沙星（levofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、恩諾沙星（enrofloxacin）、羅紅霉素（roxithromycin）、林可霉素（lincomycin）、利福平（rifampicin）、喹乙醇（olaquindox）（純度均99.9%）、D4-磺胺甲惡唑（D4-sulfamethoxazole，100 ng／μL）均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；阿奇霉素（azithromycin，純度98%）購自英國Fluorochem 公司；克拉霉素（clarithromycin，純度98%）購自上海TCI 公司。

甲醇和乙腈均為色譜純，購自美國Tedia 公司；甲酸為分析純，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硅藻土（美國Dionex 公司）于450 ℃焙燒3 h，置于干燥器內(nèi)備用；C18 填料（平均粒徑50 μm，孔徑6 nm，碳載量17%；濟南博納生物技術(shù)有限公司）使用前浸泡在甲醇中3 h 以上，最后用氮氣吹干。超純水（18.2 MΩ·cm，25 ℃）由HealForce 系統(tǒng)（上海力康儀器有限公司）制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶解并定容到10 mL 棕色容量瓶中，配制成1 000 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，在-18 ℃下避光保存（3 個月內(nèi)使用）。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇定容至10 mL，配制成已知濃度的中間標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用1.4 節(jié)中的初始流動相稀釋成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，密封于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

將新鮮樣品解剖、去皮，取背部肌肉剪碎后，準(zhǔn)確稱取1.000 g 肌肉樣品，加入適量預(yù)萃取過的硅藻土，研磨混勻；萃取池（10 mL）底部鋪上2.000 g的C18 填料，將混勻好的樣品填入萃取池，并加入50 ng 回收率指示物D4-磺胺甲惡唑；設(shè)置的萃取條件:壓力10 477.5 kPa，溫度70 ℃，靜態(tài)萃取時間5 min，沖洗溶劑體積為池容積的60%，氮氣吹掃時間120 s，靜態(tài)循環(huán)2 次。將萃取池置于ASE 350 上進行加溫加壓萃取。將收集的萃取液轉(zhuǎn)移至30 mL離心管內(nèi)，在-4 ℃、15 000 r／min 條件下離心20 min，取上層清液并在40 ℃水浴下氮吹至近干，加入初始流動相溶解、定容至1 mL 后待測。

1.4 儀器分析

色譜柱為Xterra MS C18 （100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；0.1% （v／v）甲酸水溶液（含0.1% （v／v）甲酸銨）為流動相A，甲醇-乙腈（1∶1，v／v）為流動相B；流速0.3 mL／min；梯度洗脫條件:0 ～30 min，5% B ～88% B；柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件:分析物在電噴霧離子源正離子（ESI＋）掃描下以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式分析；優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。其他優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù):輔助氣壓力（N2）為8 L／min；霧化氣壓力為172.4 kPa；氣化溫度為350 ℃；電噴霧電壓為4 000 V（＋／ -）。

表1 19 種抗生素及2 種磺胺代謝產(chǎn)物優(yōu)化的串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized MS／MS parameters of the 19 antibiotics and 2 sulfonamide metabolites

1.5 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

所有玻璃器皿用自來水超聲清洗30 min，用自來水清洗干凈后，再用去離子水洗3 次，烘干后依次用二氯甲烷、丙酮、甲醇各洗2 次，待溶劑揮發(fā)完全后置于馬弗爐中于450 ℃下燒3 h，自然冷卻后取出待用。

樣品在提取前添加回收率指示物標(biāo)準(zhǔn)品，以控制整個樣品前處理過程的回收率，指示物的回收率范圍為65.4% ～78.9% 。同時進行方法空白、基質(zhì)加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)平行樣及樣品平行樣的測定，以進行質(zhì)量控制與質(zhì)量保證。

在每批樣品進行儀器分析前，用空白溶劑和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品檢查儀器的靈敏度和穩(wěn)定性，同一標(biāo)準(zhǔn)樣品測定的誤差小于20% 方可進行樣品測定，否則需對儀器進行調(diào)試［16］。

為了保證目標(biāo)化合物識別的準(zhǔn)確性，采用如下2 個標(biāo)準(zhǔn):（a）色譜保留時間在標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的0.75 min 之內(nèi)；（b）信噪比（S／N）大于3∶1［17］。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法空白、回收率及檢出限

21 種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖1 所示，由此可見在本文建立的色譜條件下，大多數(shù)目標(biāo)化合物都有較好的分離。對1.25 ～5 000 μg／L 5 個質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)化合物分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。21 種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r2）均在0.991 以上，說明各目標(biāo)化合物在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系。

加標(biāo)基質(zhì)（為了模擬真實的生物基質(zhì)環(huán)境，本實驗以本實驗室飼養(yǎng)的條件可控的鯉魚肌肉組織作加標(biāo)基質(zhì)）中，左氧氟沙星、諾氟沙星、依諾沙星有檢出。在本實驗條件下，采用重復(fù)萃取1 遍的鯉魚肌肉組織（仍有少量檢出）作空白基質(zhì)，連續(xù)分析7次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）；根據(jù)國際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）對檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的定義［18］，得到21 種目標(biāo)物的LOD 和LOQ 分別為0.003 ～0.6 ng／g 和0.01 ～2.02 ng／g（見表2），表明方法有較高的靈敏度。

圖1 21 種目標(biāo)分析物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution of the 21 target compounds

采用本實驗室條件可控的鯉魚肌肉組織按照低、中、高3 個添加水平進行加標(biāo)回收測定，平行測定6 次，測定結(jié)果經(jīng)空白校正，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，該方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度，低、中、高3 個添加水平的方法回收率（n ＝6）分別為55.2% ～110.7%、55.3% ～112.8%、60.6% ～113.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.1% ～17.6%、1.9% ～14.5%、2.3% ～13.5%。其中，ENX、ENR、AZI 和OLA 的加標(biāo)回收率偏低。已有研究表明，喹諾酮類抗生素的吸附能力較強［15］，而大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有較強的親脂性［19］，因此推斷原因可能是基質(zhì)影響干擾了其萃取過程。類似結(jié)果在前人研究［20，21］中已有報道。

表2 21 種目標(biāo)物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges，r2，LODs and LOQs of the 21 analytes

表3 魚肌肉中21 種目標(biāo)物質(zhì)的加標(biāo)回收率及精密度（n ＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the 21 analytes spiked in fish muscle samples （n ＝6）

2.2 實際樣品分析

使用本文建立的方法對2014 年3 月萊州灣某海水養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)采集的兩種野生海魚（矛尾復(fù)蝦虎魚（Synechogobius hasta）和梭魚（Liza haematocheilus））肌肉樣品進行定量分析。結(jié)果表明，有6種抗生素被檢出（經(jīng)空白校正）；而喹諾酮類抗生素在魚體內(nèi)的殘留水平和檢出頻率（3／3）均較高，其中諾氟沙星的平均含量分別高達67.01、27.58 ng／g（見表4）。與其他近海海域抗生素在海洋生物體內(nèi)的殘留水平［22］相比，該區(qū)域的魚體內(nèi)抗生素殘留水平較高。盡管其殘留水平較低，但考慮其長期和大規(guī)模的使用，抗生素對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響仍不容忽視。

表4 兩種海魚肌肉中抗生素含量及檢出頻率（n ＝3）Table 4 Contents and frequencies of detected antibiotics in the muscles from two kinds of fish （n ＝3）

3 結(jié)論

本文采用池內(nèi)同步凈化的ASE 技術(shù)，建立了一種快速簡便的魚肌肉中多種抗生素殘留的HPLCESI-MS／MS 分析方法。該方法具有良好的回收率、重現(xiàn)性和較高的靈敏度，為進一步研究抗生素的暴露水平和環(huán)境行為奠定了基礎(chǔ)。采用該方法對萊州灣海水養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)采集的魚類樣品進行分析發(fā)現(xiàn)，有6 種抗生素被檢出，喹諾酮類抗生素在魚體內(nèi)的殘留水平較高。

［1］ Li Z X，Tian B K，Zuo J E，et al. Environmental Engineering（李再興，田寶闊，左劍惡，等. 環(huán)境工程），2012，30（2）:72

［2］ Food and Agriculture Organization of the United Nations（FAO）. The State of World Fisheries and Aquaculture 2012.Rome:FAO Fisheries and Aquaculture Department，2012:27

［3］ Wang D，Sui Q，Zhao W T，et al. Chinese Science Bulletin（王丹，隋倩，趙文濤，等. 科學(xué)通報），2014，59（9）:743

［4］ Gao P P，Mao D Q，Luo Y，et al. Water Res，2012，46（7）:2355

［5］ Willmott A，McCombie A，Rossleigh M. Intern Med J，2011，41（Suppl 3）:25

［6］ Sun W H，Leng K L，Wang Z J，et al. Food Science （孫偉紅，冷凱良，王志杰，等. 食品科學(xué)），2009，30（24）:294

［7］ Zhou Q，Peng D P，Wang Y L，et al. Food Chem，2014，154:52

［8］ Yu H，Tao Y F，Chen D M，et al. J Chromatogr B，2012，885:150

［9］ Tao Y F，Yu G，Chen D M，et al. J Chromatogr B，2012，897:64

［10］ Gentili A，Perret D，Marchese S，et al. J Agric Food Chem，2004，52（15）:4614

［11］ Yang C Q，Wang L X，Hou X H，et al. Chinese Journal of Chromatography （楊常青，王龍星，侯曉虹，等. 色譜），2012，30（8）:756

［12］ Meng J，Yang Y H. Chinese Journal of Food Hygiene （孟娟，楊永紅. 中國食品衛(wèi)生雜志），2012，24（6）:546

［13］ Gong Q，Ding L，Zhu S H，et al. Chinese Journal of Chromatography （龔強，丁利，朱紹華，等. 色譜），2012，30（11）:1143

［14］ Ding Y J，Zhang W H，Gu C，et al. J Chromatogr A，2011，1218（1）:10

［15］ Li W H，Shi Y L，Gao L H，et al. Journal of Instrumental Analysis （厲文輝，史亞利，高立紅，等. 分析測試學(xué)報），2010，29（10）:987

［16］ Zhao H，Meng X Z，Xiang N，et al. Environmental Chemistry （趙恒，孟祥周，向楠，等. 環(huán)境化學(xué)），2012，31（5）:573

［17］ Zhu L Y，Hites R A. Environ Sci Technol，2006，40（12）:3711

［18］ IUPAC. Pure Appl Chem，1976，45（2）:107

［19］ Runnqvist H，Bak S A，Hansen M，et al. J Chromatogr A，2010，1217（16）:2447

［20］ Carretero V，Blasco C，Picó Y. J Chromatogr A，2008，1209（1／2）:162

［21］ Pecorelli I，Galarini R，Bibi R，et al. Anal Chim Acta，2003，483（1／2）:81

［22］ Na G S，F(xiàn)ang X D，Cai Y Q，et al. Mar Pollut Bull，2013，69（1／2）:233