李 娜， 張玉婷， 劉 磊， 邵 輝， 李 輝， 李 晶， 郭永澤

（天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津300381）

近幾年，隨著食品安全問(wèn)題日益被重視，食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)面臨大量的檢測(cè)工作。實(shí)現(xiàn)多類獸藥同時(shí)檢測(cè)是許多獸藥殘留分析工作者努力的目標(biāo)。金剛烷胺是禁用藥物，磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類獸藥是獸醫(yī)臨床上常用且容易被濫用的藥物，農(nóng)業(yè)部對(duì)上述獸藥也制定了最大殘留限量（MRLs）標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立獸藥多殘留快速檢測(cè)方法非常有必要。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢(shì)，已成為復(fù)雜的動(dòng)物組織樣品中多類獸藥殘留同時(shí)檢測(cè)的主流方法［1-7］。這些方法有的同時(shí)檢測(cè)受體激動(dòng)劑、喹諾酮和磺胺類獸藥［1］，有的同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素類與喹諾酮類獸藥［2］，有的同時(shí)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯、磺胺類和氟喹諾酮類［3-6］。但是，四環(huán)素類獸藥理化性質(zhì)特殊，較難與其他多類獸藥同時(shí)提取、凈化，因此，文獻(xiàn)報(bào)道也較少［7-10］。

QuEChERS 方法快速、簡(jiǎn)便、成本低廉、易于操作，已逐步被應(yīng)用于多類獸藥殘留檢測(cè)［8-16］。本研究采用改進(jìn)的QuEChERS 方法提取、凈化樣品，解決了四環(huán)素類獸藥難與其他獸藥同時(shí)檢測(cè)的難題，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，建立了動(dòng)物源食品中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和金剛烷胺4類29 種禁限用獸藥的同時(shí)快速檢測(cè)方法。與國(guó)標(biāo)方法［17，18］和文獻(xiàn)報(bào)道方法［7-10］相比，本研究所建方法操作更簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)成本更低，適用于各食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品中禁限用獸藥殘留的日常監(jiān)控。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AcquityTMUPLC 超高效液相色譜儀，Quattro Premier XE 三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）（美國(guó)Waters 公司）；QL-901 旋渦混合器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；H1650 臺(tái)式高速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Laborota 4000 efficient 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）。

29 種獸藥包括磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、金剛烷胺、磺胺甲基嘧啶、麻保沙星、磺胺二甲基嘧啶、四環(huán)素、氧氟沙星、土霉素、諾氟沙星、單諾沙星、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噻二唑、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、金霉素、二氟沙星、沙拉沙星、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、強(qiáng)力霉素、惡喹酸、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和氟甲喹，標(biāo)準(zhǔn)品純度均不低于99%，購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司；乙腈、甲酸為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Fisher 公司；氯化鈉為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。吸附劑HLB 購(gòu)自北京市廣普達(dá)科技有限公司，吸附劑C18、PSA、NH2購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，磺胺類獸藥用乙腈溶解并定容，四環(huán)素類獸藥用甲醇溶解并定容，金剛烷胺用1% 甲酸乙腈溶解并定容，喹諾酮類獸藥用0.03 mol／L 氫氧化鈉溶液溶解，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃條件下保存。分別吸取29 種獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25 mL 于25 mL 容量瓶，用乙腈稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅰ；吸取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL，分別吸取四環(huán)素類獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.5 mL，分別吸取磺胺類和喹諾酮類獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL，于100 mL 容量瓶，用乙腈稀釋并定容，配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作液Ⅱ，其中金剛烷胺質(zhì)量濃度為0.1 mg／L，四環(huán)素類獸藥質(zhì)量濃度為0.5 mg／L，其他獸藥質(zhì)量濃度為1.0 mg／L。于4 ℃條件下保存，可使用一個(gè)月。

0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液（pH值4.0）的配制:準(zhǔn)確稱取12.9 g 檸檬酸（C6H8O7·H2O）、10.9 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO3·12H2O）、37.2 g Na2EDTA·2H2O，加超純水900 mL 溶解，用1 mol／L NaOH 調(diào)pH 值至4.0，加超純水稀釋至1 000 mL。

1.2 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取試樣2.00 g（精確至0.01 g）于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入2 mL 0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖溶液和3 mL 乙腈，于旋渦混合器上渦旋2 min，4 000 r／min 離心5 min，收集上清液于另一個(gè)50 mL 離心管中；殘?jiān)屑尤? mL 乙腈，于旋渦混合器上渦旋2 min，4 000 r／min離心5 min；合并上清液于上述50 mL 離心管中。于上清液中依次加入200 μL 乙酸、1 g 氯化鈉，于旋渦混合器上渦旋1 min，4 000 r／min 離心5 min，取乙腈相（上層）2 mL 于10 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入C18 和NH2吸附劑各100 mg，渦旋1 min，4 000 r／min 離心5 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)屑尤? mL 甲醇-0.1% 甲酸水（10∶90，v／v）定容，過(guò)0.22 μm 有機(jī)濾膜。

1.3 色譜條件

色譜柱:AcquityTMBEH RP18 柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相:A 相，0.1% （v／v，下同）甲酸甲醇；B 相:0.1% 甲酸水；梯度洗脫程序:0～3 min，5% A ～20% A；3 ～7 min，20% A ～40%A；7 ～10 min，40% A；10 ～11 min，40% A ～90%A；11 ～12 min，90% A；12.1 min，5% A；12.1 ～14 min，5% A。進(jìn)樣量:10 μL；柱溫:30 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

電離模式:電噴霧正離子（ESI （＋））；毛細(xì)管電壓:3.0 kV；離子源溫度:110 ℃；脫溶劑氣溫度:380 ℃；脫溶劑氣流量:550 L／h；錐孔反吹氣流量:50 L／h；檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）；質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 29 種獸藥的保留時(shí)間、質(zhì)譜檢測(cè)條件、基質(zhì)匹配線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限和定量限Table 1 Retention times，mass spectrometric conditions，matrix-matched linear equations，correlation coefficients （r），LODs and LOQs for the twenty-nine veterinary drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

在電噴霧正離子模式下分別對(duì)1 mg／L 的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，得到每種獸藥的分子離子，然后對(duì)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，選擇信號(hào)強(qiáng)度較大的兩個(gè)碎片離子為特征子離子，并優(yōu)化得到每種獸藥的母離子和子離子所需的最佳錐孔電壓和碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行掃描。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.2 梯度洗脫條件的優(yōu)化

本研究分別以乙腈-0.1% 甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，比較二者的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-0.1% 甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，29 種獸藥的分離效果更好。

甲醇與0.1% 甲酸甲醇的比較:由于采用梯度洗脫，本研究嘗試在流動(dòng)相甲醇中也加入0.1% 甲酸，以確認(rèn)是否有助于化合物的電離。結(jié)果表明，加入甲酸后獸藥的響應(yīng)信號(hào)果然更強(qiáng)，重復(fù)性更好。因此，本研究最終采用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作為流動(dòng)相。

梯度洗脫條件的優(yōu)化:經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，改變不同時(shí)間段流動(dòng)相中有機(jī)相與水相的比例，最終確定了最佳梯度洗脫條件，獲得了29 種獸藥的最佳分離效果，29 種獸藥的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 29 種獸藥的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the 29 veterinary drugs

2.2 定容溶液的選擇

用UPLC-MS／MS 檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)物的色譜峰形、分離度及響應(yīng)值受定容溶液的影響較大。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，本研究對(duì)以下5 種定容溶液進(jìn)行比較。（1）比較甲醇-水（10∶90，v／v）和甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）的溶解效果。結(jié)果表明:0.1% 甲酸作為水相溶解效果更好，色譜分離度更好，響應(yīng)信號(hào)更高，色譜峰對(duì)稱，尖銳。（2）乙腈和甲醇的比較:比較乙腈-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）和甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v／v）的溶解效果。結(jié)果表明，二者無(wú)明顯差異，分離效果都很好，所得色譜峰尖銳、對(duì)稱。（3）甲醇-0.1% 甲酸不同比例的比較:根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，選取10∶90、20∶80 和50∶50（v／v）3 種比例進(jìn)行比較。結(jié)果表明，比例為10∶90 時(shí)效果最好，比例為50∶50時(shí)效果最差。甲醇的比例越高，色譜峰前延現(xiàn)象越明顯，分離度也越差，這種影響在磺胺醋酰和磺胺嘧啶兩種化合物上體現(xiàn)得最明顯。因此，鑒于流動(dòng)相使用甲醇，本研究最終采用甲醇-0.1% 甲酸水（10∶90，v／v）作為定容溶液。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇是本研究的難點(diǎn)。四環(huán)素類獸藥很難與磺胺類、喹諾酮類獸藥同時(shí)提取。參照文獻(xiàn)，本研究先后采用乙腈［1，6，8］、5% 醋酸乙腈［4，14-16］、0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液［2，16］、5% 三氯乙酸［5］和0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈混合溶液［7］5 種溶液進(jìn)行提取。結(jié)果表明，乙腈提取時(shí)金剛烷胺、喹諾酮類和四環(huán)素獸藥的回收率都較低；5% 醋酸乙腈提取時(shí)四環(huán)素類獸藥回收率僅20% ～30%；0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液可以很好地提取四環(huán)素類和喹諾酮類獸藥，但磺胺類的回收率僅50% 左右；0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈混合溶液提取時(shí)，4 類獸藥的回收率都能夠滿足要求；5% 三氯乙酸提取，沉淀蛋白的同時(shí)，也能很好地提取4 類獸藥。因此，最終選擇0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液-乙腈或者5% 三氯乙酸作為提取液。

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)摸索，本研究最終確定稱樣2.00 g 時(shí)，加0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液的體積以2 mL 為宜，提取兩次，第一次用2 mL McIlvaine 緩沖液和3 mL 乙腈提取，第二次用5 mL 乙腈提取。

2.3.2 凈化方法的確定

本研究設(shè)計(jì)了兩種試驗(yàn)方案。方案一:采用0.1 mol／L Na2EDTA-McIlvaine 緩 沖 溶 液-乙 腈 提取，鹽析，取2 mL 乙腈相，C18、PSA 或NH2分散固相萃取凈化（吸附雜質(zhì)），上清液氮?dú)獯蹈桑? mL 甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）定容。方案二:采用5%三氯乙酸提取，取2 mL 提取液，HLB 分散固相萃取凈化（吸附目標(biāo)獸藥），用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑? mL 甲醇-0.1% 甲酸（10∶90，v／v）定容。結(jié)果表明:方案一的凈化效果好，4 類獸藥的回收率結(jié)果都能滿足要求。方案二凈化效果雖好，但4 類獸藥的回收率均小于60%。因此，選擇方案一的方法凈化。

吸附劑的選擇及用量:比較了C18、PSA 和NH23 種吸附劑的凈化效果。結(jié)果表明，PSA 吸附磺胺類獸藥，C18 和NH2協(xié)同凈化效果較好。在2 mL提取液中分別加入C18 和NH2各50 mg、100 mg、150 mg 進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，用量150 mg 時(shí)，少量獸藥被吸附，用量100 mg 時(shí)比50 mg 凈化效果好，且不會(huì)吸附獸藥。因此，本研究確定C18 和NH2的用量為100 mg。

鹽析前加乙酸調(diào)pH 值的必要性:加乙酸200 μL，調(diào)pH 值至3.5，目的是為了降低四環(huán)素類獸藥在緩沖液中的溶解性，使其更易分配至乙腈相中，以提高回收率。

2.4 方法的線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

為了消除基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。29 種獸藥在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.993 ～0.999。以信噪比為3 計(jì)算方法的檢出限，以信噪比大于等于10 確定方法的定量限，29種獸藥的檢出限在0.3 ～3.0 μg／kg 之間。金剛烷胺的定量限為1.0 μg／kg，四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的定量限均為10.0 μg／kg，其他獸藥的定量限均為5.0 μg／kg。

在29 種獸藥的LOQ 水平、20 μg／kg 和50 μg／kg 3 個(gè)水平做加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平做5個(gè)平行樣品。稱取2 g 空白雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混合1 min，混勻后靜置15 min，按照1.2 節(jié)所述的前處理方法進(jìn)行提取、凈化后，進(jìn)行UPLC-MS／MS 測(cè)定。為了消除基質(zhì)效應(yīng)，用空白樣品基質(zhì)加標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)添加樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中各組分的峰面積計(jì)算回收率。29 種獸藥在4 種組織中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均列于表2 中。由表2 可以看出，29 種獸藥在雞肉、雞肝、豬肉和豬肝4 種動(dòng)物組織中的平均回收率在71.5% 和93.2% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.8% 和7.7% 之間，符合多殘留分析的要求。

表2 雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品中29 種獸藥的加標(biāo)回收率及RSD（n ＝5）Table 2 Average recoveries and the RSDs of the 29 veterinary drugs in chicken muscle，chicken liver，porcine muscle，and porcine liver samples （n ＝5）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

從天津市各超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買8 份雞肉、3份雞肝、5 份豬肉和4 份豬肝樣品，采用本研究建立的多殘留方法進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果顯示，1 份雞肉樣品檢出磺胺醋酰和磺胺嘧啶，殘留量分別為10.6 μg／kg 和13.5 μg／kg，1 份雞肝樣品檢出恩諾沙星，殘留量為24.7 μg／kg。其他樣品中均無(wú)獸藥檢出。

3 結(jié)論

本研究解決了四環(huán)素類藥物難與其他多類獸藥同時(shí)提取、凈化的難題，建立了動(dòng)物源食品中四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和金剛烷胺4 類共29 種獸藥的QuEChERS-UPLC-MS／MS 快速檢測(cè)方法。分別對(duì)液相色譜條件、質(zhì)譜條件、提取溶劑、凈化方法、吸附劑的選擇及用量等樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化研究，采用改進(jìn)的QuEChERS 方法處理樣品，發(fā)揮了其快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，與國(guó)標(biāo)方法和現(xiàn)有文獻(xiàn)方法相比，該方法大大縮短了檢測(cè)周期，節(jié)約了檢測(cè)成本。本研究方法操作簡(jiǎn)便、快速、凈化效果好，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合多殘留檢測(cè)技術(shù)的要求，為各食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供了簡(jiǎn)單快速的篩選方法，有助于食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)大批量的雞肉、雞肝、豬肉、豬肝樣品中禁限用獸藥的日常監(jiān)控。

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