肖全偉 ， 吳文林， 楊萬(wàn)林， 梁 潤(rùn)， 李紹波， 劉玲利

（1. 成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院食品中心，四川 成都610100；2. 中國(guó)空軍第34 師西郊場(chǎng)站醫(yī)院，北京100195；3. 成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都610059）

激素類(lèi)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)一般難以降解，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后，可擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢癌發(fā)生、女性性早熟等［1-3］。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002 年發(fā)布的176 號(hào)公告明確規(guī)定禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇［4］。農(nóng)業(yè)部第193 號(hào)公告明確規(guī)定禁止在所有食用動(dòng)物飼養(yǎng)中使用苯甲酸雌二醇以促生產(chǎn)或其他用途［5］。

為保障人類(lèi)動(dòng)物源性食品的安全，從飼料源頭有效監(jiān)控激素類(lèi)物質(zhì)的攝入是解決激素類(lèi)物質(zhì)在動(dòng)物源食品中殘留的有效途徑之一。因此，嚴(yán)格控制飼料中非法添加激素物質(zhì)具有重要意義。目前，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的激素殘留檢測(cè)主要針對(duì)動(dòng)物源食品［6-9］和水體［10-13］，關(guān)于飼料方面的報(bào)道還較少。同時(shí)，在飼料雌激素檢測(cè)方面，對(duì)17β-雌二醇的檢測(cè)報(bào)道較多，對(duì)苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的報(bào)道甚少［14，15］。激素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法［15，16］、高效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法［17，18］、氣 相 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［19］以及酶聯(lián)免疫法［20］。高效液相色譜法靈敏度較低，選擇性和特異性較差，不適于雌激素痕量殘留分析的要求；采用氣相色譜法的前處理較為繁瑣，需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，耗時(shí)長(zhǎng)；免疫分析法易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，僅能測(cè)定少數(shù)幾種激素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、檢出限低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，為飼料中痕量雌激素物質(zhì)的檢測(cè)提供了較好的方法。

飼料基質(zhì)本身是一種極為復(fù)雜的樣品，有效的提取和凈化才能保證雌激素含量的準(zhǔn)確測(cè)定。目前還沒(méi)有報(bào)道用SPE-UPLC-MS／MS 同時(shí)測(cè)定17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇3 種雌激素的方法。本文通過(guò)對(duì)SPE、色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了測(cè)定飼料中上述3 種雌激素的SPE-UPLC-MS／MS 方法，該法快速簡(jiǎn)便，線性范圍寬，檢出限低，準(zhǔn)確度高，適合飼料中雌激素的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Quattro Premier XE 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Elix／Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）；Allegra X-22R 冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；Promax 2020 往復(fù)式搖床（德國(guó)Heidolph 公司）；N-EVAP-24 氮吹濃縮裝置（美國(guó)Organomation公司）；MS3 漩渦混合器（德國(guó)IKE 公司）；Heaion C18固相萃取柱（500 mg／3 mL，天津市賀世科技發(fā)展有限公司）、24 位固相萃取裝置（德國(guó)CNW 公司）、BS224S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），水相0. 22 μm 聚醚砜微孔濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和同位素內(nèi)標(biāo):17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司）；13C2-17β-雌二醇（純度99%，美國(guó)CIL 公司）。

試劑:甲醇（色譜純，韓國(guó)SK 公司）；乙腈（色譜純，Sigma 公司）；甲醇、氨水（分析純，重慶市川東化工有限公司）；乙腈（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

樣品:隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)市售預(yù)混合飼料、配合飼料、濃縮飼料各10 份，每份為1 kg。

實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成100 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃下保存。使用時(shí)，用甲醇逐級(jí)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線:稱(chēng)取不含3 種待測(cè)物的飼料樣品，按1.3 節(jié)方法操作，得到空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取混合均勻的飼料樣品5 g（精確到0.1 mg）于250 mL 具塞三角玻璃瓶中，準(zhǔn)確加入適量?jī)?nèi)標(biāo)和25 mL 乙腈，140 r／min 振蕩提取30 min，5 000 r／min 離心5 min。取上清液2 mL，并加入6 mL 超純水稀釋?zhuān)靹蚝笸ㄟ^(guò)Heaion C18固相萃取小柱（經(jīng)6 mL 甲醇和6 mL 超純水預(yù)活化），保持流速約為1 mL／min，然后用3 mL 超純水淋洗小柱。待淋洗液流盡，減壓抽干，用4 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液在（50 ±1）℃下氮?dú)獯蹈?，加? mL 含30%（v／v）乙腈的水溶液溶解殘留物，溶液經(jīng)0.22 μm 聚醚砜微孔濾膜過(guò)濾，濾液上機(jī)測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters 公司）；柱溫40 ℃，流速0.3 mL／min；流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.1%氨水溶液；進(jìn)樣量為5 μL；梯度洗脫程序?yàn)?0 ～0.2 min，40%A；0.2 ～3.0 min，40%A ～90% A；3.0 ～4.5 min，90% A ～40% A；4.5 ～5.0 min，40%A。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源（ESI）；正離子（分析苯甲酸雌二醇）和負(fù)離子（分析17β-雌二醇、戊酸雌二醇、13C2-17β-雌二醇內(nèi)標(biāo)）模式；毛細(xì)管電壓:正離子模式3.5 kV，負(fù)離子模式-2.9 kV；脫溶劑氣溫度:260 ℃；脫溶劑氣流速:600 L／h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離過(guò)程是在溶液狀態(tài)下進(jìn)行，因此流動(dòng)相的組成除了影響保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)對(duì)離子化效率產(chǎn)生影響，最終影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)一些常用的流動(dòng)相物質(zhì)如甲酸、乙酸為質(zhì)子給予體，體積分?jǐn)?shù)要求低于1%；緩沖鹽乙酸銨、甲酸銨濃度要求低于10 mmol／L，所以本實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1% （v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（v／v）甲酸水溶液、甲醇-0.1 mmol／L 甲酸銨、乙腈-0.1 mmol／L 甲酸銨、甲醇-0.1%（v／v）氨水、乙腈-0.1% （v／v）氨水作為流動(dòng)相，考察各流動(dòng)相體系對(duì)于3 種雌激素分離測(cè)定的影響。結(jié)果表明，采用乙腈-0.1% 氨水作為流動(dòng)相，同時(shí)結(jié)合梯度洗脫程序縮短洗脫時(shí)間能得到較好分離，且3 種雌激素在質(zhì)譜上的響應(yīng)均較高。圖1 為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中3 種雌激素和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜提取離子流圖。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別配制3 種雌激素質(zhì)量濃度為10 μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵進(jìn)樣方式直接進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。在MS／MS 狀態(tài)下，以全掃描的方式觀察3 種雌激素的總離子流圖，選擇適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)分子離子作為母離子，并優(yōu)化母離子和子離子的錐孔電壓和碰撞能量，得到各物質(zhì)的質(zhì)譜采集參數(shù)信息見(jiàn)表1。結(jié)果表明，選擇［M-H］-作為17β-雌二醇、戊酸雌二醇、13C2-17β-雌二醇的母離子，［M ＋H］＋作為苯甲酸雌二醇的母離子時(shí)，3 種雌激素的響應(yīng)值最高。

2.3 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

對(duì)甲醇、乙腈、甲醇-水（85∶15，v／v）、乙腈-水（85∶15，v／v）等4 種提取溶劑進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，乙腈對(duì)3 種目標(biāo)物的回收率均大于90%。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 3 種雌激素和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜提取離子流圖Fig.1 MS／MS extraction ion spectra of the three exogenous hormones and the internal standard

2.3.2 固相萃取條件的優(yōu)化

考察了直接提取法、分散固相萃取法（DSPE）和SPE 對(duì)3 種雌激素的回收率和凈化效果。結(jié)果表明:采用SPE 時(shí)3 種雌激素的提取效率最高，且質(zhì)譜圖中雜質(zhì)峰較少。因此，采用SPE 提取樣品。

提 取 液 分 別 用 Cleanert PE、Heaion C18、Welchrom C18E 和Cleanert ODS C184 種SPE 小柱凈化，比較4 種SPE 小柱對(duì)樣品中3 種雌激素的回收率影響。結(jié)果表明，3 種雌激素在Heaion C18小柱上的回收率最高。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 MS acquisition parameters for multiple reaction monitoring （MRM）

選擇Heaion C18作為固相萃取小柱，分別考察了乙腈和甲醇作為洗脫劑對(duì)3 種雌激素的洗脫效果。結(jié)果顯示:當(dāng)甲醇或乙腈作為洗脫劑時(shí)，被測(cè)物的回收率均較高，洗脫效果好。由于乙腈毒性比甲醇大，沸點(diǎn)較高，氮?dú)獯蹈少M(fèi)時(shí)，因此選擇甲醇作為洗脫劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)是指樣品中除分析物以外的一切組分，主要來(lái)源于樣品中內(nèi)源性組分和樣品處理后引入的雜質(zhì)?；|(zhì)對(duì)分析物測(cè)定的影響即為基質(zhì)效應(yīng)，可影響線性關(guān)系、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）等。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察了飼料樣品對(duì)待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率比純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率小，即存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。在樣品中加入同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)待測(cè)組分的提取和測(cè)定無(wú)任何干擾，且受基質(zhì)成分的影響也極為相似。同位素內(nèi)標(biāo)不但可抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，還可消除樣品前處理過(guò)程中的差異。因此，為最大限度地消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和13C2-17β-雌二醇同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，可得到3種雌激素的準(zhǔn)確可靠結(jié)果。

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

稱(chēng)取一定量的預(yù)混合、配合和濃縮飼料的空白樣品于250 mL 具塞三角玻璃瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL乙腈，按照1.3 節(jié)操作處理樣品，得到空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，再加入適量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇質(zhì)量濃度均為5、10、20、40、60、80、200 μg／L 的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以對(duì)應(yīng)的基質(zhì)加標(biāo)溶液濃度與內(nèi)標(biāo)溶液濃度比值為橫坐標(biāo)X，相應(yīng)的待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制3 種雌二醇的內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比（S／N ＝3）確定儀器的檢出限，以10 倍信噪比（S／N＝10）確定儀器的定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)3 種雌激素的線性范圍寬，工作曲線線性良好，17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的檢出限分別為7、5 和7 μg／kg；定量限分別為20、14和20 μg／kg，適用于飼料中3 種雌激素的測(cè)定。

表2 3 種雌激素的檢出限、定量限、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Limits of detection，limits of quantification，regression equations and correlation coefficients （r）of the three estrogens

2.6 加標(biāo)回收率和精密度

在空白樣品中分別添加20、40、100、200 μg／kg 4 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)。按照1.3 節(jié)進(jìn)行樣品處理，UPLCMS／MS 測(cè)定，每個(gè)添加水平樣品重復(fù)測(cè)定6 次，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明:17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇在預(yù)混合、配合和濃縮飼料中的平均回收率分別為96.5% ～100.5%、97.2% ～102.0%和96.9% ～100.3%。

在樣品中分別添加20、100、150 μg／kg 3 個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3 節(jié)中所述方法處理樣品，每個(gè)添加水平各7 份平行樣，分別于同一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)精密度，并連續(xù)測(cè)定5 天，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示:在預(yù)混合、配合和濃縮飼料中17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇的日內(nèi)精密度為1.0% ～8.7%，日間精密度為1.4% ～11.5%。

表3 3 種飼料樣品中3 種雌激素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n ＝6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the three estrogens spiked in three feed samples （n ＝6）

2.7 飼料樣品的測(cè)定

利用該方法測(cè)定了市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的30 份飼料樣品（預(yù)混合飼料、配合飼料、濃縮飼料各10 份），每個(gè)樣品做3 個(gè)平行測(cè)定。經(jīng)檢測(cè)，30 份樣品均未檢出目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飼料中3 種雌激素（17β-雌二醇、苯甲酸雌二醇和戊酸雌二醇）的分析方法。飼料樣品采用乙腈提取，Heaion C18固相萃取，氮吹濃縮，超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便、線性范圍寬、檢出限低、準(zhǔn)確度高，能夠滿足飼料中禁用激素類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)要求，彌補(bǔ)了飼料中禁用激素類(lèi)物質(zhì)定量確證檢測(cè)方法的空白，為保障人類(lèi)和動(dòng)物健康提供了檢測(cè)技術(shù)支持。

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